渤海海域褐潮期微型浮游生物多样性的初步研究*

于 杰，张玲玲，孙 妍，张 璐，焦文倩，窦怀乾，郭浩冰，包振民

（中国海洋大学海洋生物遗传育种教育部重点实验室，山东 青岛 266003）

近年来，伴随着经济的快速发展，不规范的海洋排污、过度的水产养殖现象日益严重，致使近海水体富营养化不断提高，有害藻潮的发生频率显著增加［1］。有害藻潮发生过程中，有害藻大量聚集，使得水体严重缺氧、水下采光不足，导致生物大量死亡，破坏海洋生态系统；产生的毒素不仅能杀死鱼、贝类等海洋生物，还可直接或间接危害人类健康；此外，有害藻潮导致的水体透明度降低、变色、异味，严重阻碍旅游、娱乐行业的发展［2］。据国家海洋局发布的海洋灾害公报，仅2008—2012年中国有害藻潮造成的渔业海水养殖业直接经济损失累计达22.91亿元。

2009 年以来，每年6～7月左右在河北省渤海海域相继爆发褐潮。褐潮爆发时，水体呈褐色，褐潮优势藻浓度高达109个/L，严重影响海湾扇贝的进食，导致扇贝滞长甚至死亡［3］。据国家海洋局发布的海洋灾害公报，仅2010年该褐潮就给河北省造成了2.05亿元的经济损失。褐潮藻个体微小（约2μm）［3］，采用传统的形态学观察难以准确鉴定。相比之下，分子生物学方法具有简单、快速、准确等特点，无疑成为褐潮检测的有效手段。

18SrDNA结构和功能保守，区分力可达到种属水平，常用于物种鉴定和系统发生分析［4］。自2001年以来，它就被广泛应用于微型和超微型浮游生物的多样性研究，为海洋浮游生物组成结构分析开辟了广阔的道路［5－10］。18SrDNA含有保守区和可变区，保守序列区反映了生物种间的亲缘关系，而可变序列区则能体现物种间的差异。真核生物的18SrDNA含有8个可变区，其中可变区V9序列长度短、变异大，在分类学研究中具有较好的应用前景［11－13］。本研究拟通过对2011年7月山海关、新开口、乐亭3个渤海海域褐潮样品中微型浮游生物的18SrDNA可变区V9进行PCR扩增、测序、比对，比较不同海域微型浮游生物的结构组成，探讨褐潮的优势种，为褐潮的研究提供有力的参考。

1. 材料与方法

1.1 样品的采集

褐潮样品于2011年7月5、6日采自山海关海域的站位1（119°49′1.90″E，39°57′1.80″N）、新开口海域的站位2（119°25′49.00″E，39°34′16.00″N）以及乐亭海域的站位3（119°20′51.50″E，39°26′11.00″N）（见图1）。利用采水器于上述3海域采集500mL表层新鲜海水，用20μm微孔滤膜过滤，去除大于20μm的浮游生物后，用2μm微孔滤膜过滤收集微型浮游生物，液氮速冻后，保存于－80°C。

1.2 总DNA的提取

将2μm滤膜（约1/2张）置于1.5mL离心管中，加入600μL CTAB 缓冲液（2%CTAB；100mmol/L Tris-Cl pH＝8.0；1.4mmol/L NaCl；10mmol/L EDTA）和12μLβ－巯基乙醇，65℃水浴1h。弃滤膜，酚酚氯仿抽提2次，加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA，70%乙醇清洗沉淀，加入200ng RNaseA 37℃处理30min后，得到基因组DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，并测定DNA浓度，4℃冰箱保存备用。

图1 采样地点分布示意图Fig.1 Illustration of the sampling stations

1.3 18SrDNA可变区V9的扩增及产物3′末端加A

利用18SrDNA V9区通用引物 V9F（5′-CCCTGCCHTTTGTACACAC-3′）和 V9R（5′-CCTTCYGCAGGTTCACCTAC-3′）［11］，扩增可变区 V9：反应体系为40μL，包括1×Phusion HF Buffer、0.2mmol/L dNTPs、0.5 μmol/L 引 物 V9F、0.5 μmol/L 引 物V9R、1.25ng/μL基因组 DNA、0.8UPhusion超保真DNA聚合酶（NEB）。PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s、55℃退火30s、72℃延伸20s，20个循环；最后72℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，进行PCR产物纯化，测定产物浓度，进行3′末端加A：反应体系32μL，包括纯化后的PCR产物500ng、2UTaq酶、0.2mmol/L dATP、1×Taq Buffer、1.4mmol/L MgCl2，72℃反应20min后进行产物纯化备用。

1.4 克隆、测序与序列分析

将上述纯化产物按照pMD18-T Vector kit（Takara）说明书步骤连接到T载体上。将连接产物与DH5α感受态细胞于1.5mL离心管中混匀，42℃热激90s，快速移至冰上。3～5min后，4℃2 000r/min离心2～3min。弃掉上清，向沉淀中加入500μL LB培养基，37℃培养20～30min后，涂布于加有氨苄青霉素的平板上，倒置培养过夜。每个站位用菌落PCR技术挑选50个阳性克隆，送上海生工生物工程公司进行Sanger测序。将测得的序列去掉两端的V9引物序列，利用BLASTN与NCBI数据库进行比对，查找同源序列。

1.5 指数的计算

本研究对三站位的真核微型浮游生物多样性指数（香农－维纳指数Shannon-Wiener index，H）、丰富度指数（Margalef index，D）及褐潮优势藻优势度指数（Berger-Parker优势度指数，Y）分析，各指数的计算公式如下：

其中：pi为第i个OTU所占序列的比例；S为OTU个数；Nmax为优势OTU的序列数；N为总序列数。

2 结果

2.1 各站位克隆文库多样性比较

BLASTN比对结果显示，山海关、新开口和乐亭测得的序列中，能比对到属及属以下的序列数分别为44、29和36条（见表1）。

表1 18SrDNA V9可变区BLASTN比对结果Table 1 BLASTN results of the 18SrDNA V9hypervariable region amplicons

续表1

分析发现，山海关仅含有4门7属7种生物，而新开口和乐亭分别含有8门16属18种和9门20属20种生物。新开口和乐亭2站位的香农－维纳指数和Margalef丰富度指数数值均相近，且大大高于山海关（见表2），说明新开口和乐亭的物种多样性及丰富度均高于山海关。

其中浮生藻（Pelagophyceae）、硅藻（Bacillariophyta）和绿藻（Chlorophyta）为3个站位所共有；其中浮生藻全部比对到抑食金球藻（Aureococcusanophagefferens），分别占山海关、新开口和乐亭测序总数的74%、12%和6%；硅藻占山海关、新开口和乐亭测序数的4%、8%和24%；绿藻分别占4%、4%和14%。甲藻（Dinophyceae）为山海关和新开口2站位所共有，分别占2个站位测序数的6%和12%，而纤毛虫（Ciliophora）、丝足虫（Cercozoa）和隐藻（Cryptophyta）存在于新开口和乐亭，分别占新开口和乐亭测序总数的12%和16%、4%和4%、4%和4%。定鞭藻（Haptophyceae）为新开口所特有，占新开口测序数的2%，金藻（Chrysophyceae）和甲壳类（Crustacea）为乐亭所特有，各占2%。各站位微型浮游生物的多样性分布见图2。

表2 各站位Shannon-Wiener指数和Margalef指数Table 2 Shannon-Wiener index and Margalef index at each station

图2 3个站位中微型浮游生物的多样性分析Fig.2 Diversity of nanoplankton at each station

2.2 各站位含量较高物种的比较

图3 各站位中含量较高的物种分布图Fig.3 Distribution of abundant species at each station

比较各站位中序列数较多（≥2）的物种（见图3），结果显示，抑食金球藻在3个站位含量都很高，山海关为37条，新开口为6条，乐亭为3条；多形微眼藻（Minutocelluspolymorphus）在乐亭和新开口中含量较高，乐亭为9条，新开口为2条；此外，有一些物种是不同站位所特有的，比如：山海关海域有甲藻Peridiniuminconspicuum，新开口海域有纤毛虫Pelagostrobilidiumminutum和Strombidinopsisacuminata、甲藻Dinophyceaesp.和隐藻Teleaulaxacuta，乐亭海域有纤毛虫Strombidiumsp.、丝足虫Cercomonasvolcana、硅藻Cyclotellachoctawhatcheeana和绿藻Nannochlorissp.。另外，在新开口海域发现了1种丰度较高的未知物种，该序列是新开口海域中含量最高的，占新开口测序总数的16%。

2.3 2种褐潮优势藻在各站位中的分布情况

进一步分析2种褐潮优势藻，即抑食金球藻和多形微眼藻在3个站位中的分布情况（见图4），结果显示，山海关和新开口中抑食金球藻的优势度均高于多形微眼藻，前者在山海关和新开口海域优势度分别为0.74和0.12，而后者仅为0.02和0.04；乐亭的优势藻为多形微眼藻，优势度达到0.18，高于抑食金球藻（0.06）。

图4 2种褐潮优势藻在各站位的优势度分布情况Fig.4 Dominance degree of the two dominant species at each station

3 讨论

渤海海域褐潮优势藻为圆球体，直径约2μm，属于微型浮游生物。为更全面地研究褐潮爆发期微型浮游生物的组成结构，本次研究选取了渤海海域自山海关至乐亭长达38海里海域的3个站位，对其微型浮游生物的18SrDNA可变区V9进行了克隆测序。结果显示，3个站位都含有较高丰度的抑食金球藻，同时，该藻呈金光色球形或亚球形，直径2μm左右［13］，与渤海褐潮优势藻的形态相符。根据以上分析，作者推测抑食金球藻很可能为渤海海域褐潮的主要优势藻，这与张清春等人对秦皇岛洋河口海域（119°26′34.68″E，39°45′30.00″N）褐潮藻的研究结果一致［3］。

迄今为止，抑食金球藻已经在多个国家引发了褐潮。1985年夏季，抑食金球藻首次在美国长岛沿海、罗德岛、纳拉干塞特湾、班梅盖特湾新泽西州等海域引发大面积的褐潮，最高浓度达（1～3）×109个/L［14－16］。褐潮爆发期间，海湾扇贝、硬壳蛤等养殖贝类的生长受到严重阻碍，给当地的生态环境和贝类养殖业带来了严重的损失［15，17－18］。此外，该 藻 于 1997 年 在 南 非 萨 尔 达尼亚湾也引发了褐潮，使得当地的生态环境和渔业养殖业损失严重［19］。自2009年起，我国渤海海域每年夏季都会爆发褐潮，导致养殖区内海湾扇贝大量死亡，使中国成为第三个遭到褐潮影响的国家。抑食金球藻之所以能在弱光、高有机物和高金属离子的褐潮环境中占据优势，主要是由于其基因组中具有较多的涉及捕光、有机碳、氮利用和金属酶的编码基因，这使其比其它浮游植物更适应褐潮的环境［20］。

本研究还发现了除抑食金球藻外的另一种优势藻－多形微眼藻，该藻属硅藻门、微眼藻属，长2.1～3.4 μm，细胞呈圆形、近圆形或长椭圆形。研究显示，该藻在3个站位均可检测到，在乐亭海域的丰度最高。褐潮爆发期间多形微眼藻丰度较高这一现象，在1985年美国纳拉干塞特湾褐潮中也有报道［21］。根据国外学者的研究，褐潮爆发后，除抑食金球藻外，还伴随中肋骨条藻（Skeletonemacostatum）、假微型海链藻（Thalassiosirapseudonana）和多形微眼藻的增长［21］。但与美国1985年褐潮不同的是，本研究只检测到了多形微眼藻，并未发现中肋骨条藻和假微型海链藻。此外，Christopher等［22］的研究也发现，多形微眼藻能降低海湾扇贝幼虫的生长率，与渤海海域褐潮期观察到的海湾扇贝幼虫的滞长现象一致。

综合以上研究结果，抑食金球藻和多形微眼藻在3个褐潮海域均有分布，且二者在光镜下大小相近，形态相似，都能抑制海湾扇贝的生长，与实际观察的渤海褐潮现象相符；除此之外，国外学者研究发现二者在褐潮爆发时可大量共存［21］。由此推测，渤海海域褐潮可能是由抑食金球藻和多形微眼藻共同作用而成。2种优势藻在3个站位的分布情况不同，抑食金球藻在山海关海域的含量最高，其次是新开口，再次是乐亭，而多形微眼藻则相反，这可能与2种藻的生长习性有关，其机制还有待于进一步研究。

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