雌激素受体基因多态性、膳食大豆摄入与乳腺癌患病风险的关系

陶 苹，余晓红，刘 莉，王 琼，齐亚娜，李 卉△，李佳圆

(1．四川省肿瘤医院乳腺外科，成都610041;2．成都市妇女儿童中心医院体检科，成都610041;3．成都市妇女儿童中心医院妇女保健中心，成都610041;4．四川大学华西公共卫生学院，流行病与卫生统计学系，成都610041)

人类正常乳腺组织雌激素受体α(estrogen receptor α，ERα)过度表达可能会增加乳腺癌发生风险。XbaⅠ(rs9340799)是人群研究较为关注的ERα基因多态性位点。该位点位于ERα基因(人类染色体6q25．1)第1内含子内，于第2外显子上游351bp处发生A→G(x→X)基因突变［1］。该突变可能会影响正常乳腺组织ERα基因某些区域外显子的选择性剪接，从而降低ERα蛋白的表达活性［2］。此外，研究发现不同剂量的大豆异黄酮对正常乳腺组织ERα表达具有不同方向的调节作用［3-4］。本课题开展基因-环境交互作用研究，探讨雌激素受体α基因XbaⅠ酶切片段多态性(简称:XbaⅠ多态性)、膳食大豆摄入与乳腺癌风险的关系。

1 材料与方法

1．1 研究对象

2010年7月至2012年6月序贯收集来源于四川省肿瘤医院经组织病理学诊断的原发性乳腺癌新发病例。对照组来源于成都市妇女儿童医学中心的健康体检女性。病例对照年龄30～70岁，均居住于四川省10年以上者。病例排除转移性乳腺癌患者，精神疾病及其它内分泌疾病患者。对照排除放射线等职业暴露史、恶性肿瘤、内分泌疾病、生殖系统疾病以及精神疾病患者。调查对象均签署知情同意书。

1．2 研究方法

1．2．1 样本量计算 样本量计算采用QUANTO(1．2．4版)专用软件(美国南加利福尼亚大学开发)估计基因-环境交互作用样本量，参数设定如下:(1)检验水准和检验效能:双侧α=0．05，检验效能为0．8;(2)等位基因频率:参照文献，汉族女性XbaⅠ野生等位基因携带率为71．1%［5］;(3)环境因素暴露率:根据课题组前期研究结果，膳食大豆高摄入比例约为45．5%［6］;(4)基因主效应(G)、环境主效应(E)及交互效应(G-E):由于XbaⅠ人群研究结论尚不一致，采用ORg=1．0;根据本课题组前期研究结果，取 ORe=0．50［6］;交互效应 OReg在0．20～0．40间变化时，研究所需病例对照样本量在124～281对之间变化。本次研究最终收集样本量为病例对照各291例。

1．2．2 调查方法 现场调查采用问卷收集研究对象一般人口学特征、女性月经史、生育史、吸烟、饮酒、乳腺癌家族史、乳腺良性疾病史等信息。采用频数调查和单次摄入量调查结合的方法，调查研究对象最近五年的常见大豆类食物摄入情况。随机抽取5%研究对象于调查两周后重新进行问卷复核，两次回答一致率为90%。

1．2．3 基因型检测 基因型检测采用EDTA抗凝管收集研究对象的外周静脉血5ml，-20℃保存。采用天根生化科技(北京)有限公司全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。采用限制性片段长度多态性技术检测XbaⅠ(rs9340799)基因多态性。目的基因扩增采用巢式 PCR技术，利用Primer Premier5．0引物设计软件设计PCR引物。外侧引物:上游5’-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3’;下游 5’-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTAT-CTGA-3’。内侧引物:上游5’-AGGCTGGGCTCAAACTACAG-3’，下游 5’-CTCTGGGAGATGCAGCAGAT-3’。采用北京康为世纪生物科技有限公司XbaⅠ内切酶(1U/μl)对目的位点进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳，于凝胶成像系统紫外灯下观察酶切结果。如图1所示，仅出现一条316bp条带，为野生纯合型(xx);存在615bp和316bp两条带，为突变杂合型(Xx);仅出现一条615bp条带，为突变纯合型(XX)。随机抽取10%的样本进行基因型重复检测，重测结果一致率为100%。

图1 XbaⅠ多态性位点电泳图

1．3 统计分析

2 结果

2．1 乳腺癌危险因素病例及对照组间比较

本研究病例组和对照组平均年龄分别为48．00±10．96 岁和47．64 ±8．90岁，差异无统计学意义(t=-1．65，P＞0．05)。总人群及绝经前后亚组危险因素筛选结果详见表1，总人群中，文化程度、家庭人均月收入、月经状态、体质指数(body mass index，BMI)、初潮年龄、初产年龄、活产次数、哺乳情况在病例及对照组间分布差异有统计学意义(P＜0．05)。绝经前女性中，文化程度、家庭人均月收入、初潮年龄、初产年龄、活产次数、哺乳情况在组间分布差意义异有统计学(P＜0．05)。绝经后女性中，文化程度、家庭人均月收入、BMI、初产年龄、活产次数、哺乳时间、是否服用雌激素存在组间分布差异(P ＜0．05)。

表1 乳腺癌常见危险因素变量筛选结果

2．2 XbaⅠ多态性主效应

总人群中，对照组 x等位基因携带率为78．2%。对照组XbaⅠ位点基因型频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(XbaⅠ:χ2=0．001，P=0．98)。在总人群、绝经前及绝经后女性中，XbaⅠ基因型分布与乳腺癌患病风险间无统计学关联(Xx vs．xx:OR=0．61～0．82;XX vs．xx:OR=0．60～3．62;Xx+XX vs．xx:OR=0．61～0．92，95%CI均包括1)。见表2。

2．3 膳食大豆主效应

总人群中病例组DISI摄入量中位数为7．36 mg/d(QU-QL=14．42 mg/d);对照组 DISI摄入量中位数为 9．62 mg/d(QU-QL=12．84 mg/d)。总人群和绝经后人群中，DISI摄入量与乳腺癌患病风险呈负相关(总人群:OR=0．64，95%CI:0．42～0．97;绝经后:OR=0．40，95%CI:0．19～0．81)。但在绝经前人群中未发现二者的关系。见表2。

表2 XbaⅠ多态性、膳食大豆摄入与乳腺癌风险的关系

表3 XbaⅠ多态性和膳食大豆摄入的联合效应

2．4 XbaⅠ多态性和膳食大豆的协同效应

总人群中，与xx野生基因型相比，携带X突变等位基因的女性乳腺癌患病风险无明显变化;DISI高摄入组乳腺癌患病风险有所降低(OR=0．60，95%CI:0．36～1．01);携带 X等位基因同时 DISI高摄入女性乳腺癌风险进一步降低(OR=0．47，95%CI:0．25～0．89)。相乘交互系数 IOR 为1．15(0．49～2．76)。相加交互系数 RERI为 0．19(-0．35～0．73)、API为 0．41(-0．75～1．57)、S 为0．73(0．34～1．59)见表 3。亚组分析未发现 XbaⅠ多态性与膳食大豆的协同作用。

3 讨论

雌激素受体XbaⅠ位点是人群研究较为关注的雌激素受体易感基因多态性位点。Maruyama等［2］的体外试验发现携带x等位基因的ERα表达活性增高。但本研究尚未观察到XbaⅠ多态性与乳腺癌患病风险的关系。这与此前国内外部分人群研究结论一致。但来自中国、韩国和挪威的人群研究发现携带X等位基因可降低乳腺癌患病风险［5，11-12］。研究间结论不一致的原因可能与研究间样本量差异、各研究人群代表性有关。但总的说来，目前大部分研究报道的XbaⅠ的风险效应较弱(OR＜2，OR 95%CI下限接近1)，说明其对乳腺癌风险的贡献较小。

大豆异黄酮对ERα表达的调节比较复杂。Wood［3］等发现高剂量服用大豆异黄酮(240mg/d)的卵巢切除的雌性哺乳动物，乳腺组织ERα活性标记物pS2表达量明显降低。但有体外试验发现，大豆异黄酮中主要成分之一染料木苷低浓度即可诱导人和啮齿类动物的上皮细胞ERα表达，刺激细胞生长［4］。本研究发现中国女性膳食大豆摄入对乳腺癌患病风险呈保护作用，尤其在绝经后女性中更为明显。该研究结果与多项人群研究结论一致。最近一项大样本Meta分析［13］显示，亚洲女性膳食大豆摄入可明显降低其乳腺癌患病风险(合并OR=0．86，95%CI:0．77-0．95)，且对绝经后女性具有更明显的保护作用。

由于基础研究发现XbaⅠ多态性、大豆异黄酮摄入可能会通过影响乳腺组织ERα表达水平从而影响乳腺细胞增殖，因此推测XbaⅠ多态性、膳食豆类摄入在影响乳腺癌患病风险上可能存在共同的作用环节，进而可能存在生物学交互作用。本研究采用分层分析估计XbaⅠ多态性、膳食大豆的统计学交互作用。结果显示总人群中，既携带X等位基因又膳食大豆高摄入的女性乳腺癌患病风险明显降低，其风险降低程度明显低于仅X等位基因暴露组和仅膳食大豆高摄入组，这提示二者可能存在相乘模式下的交互作用，且作用模式符合超相乘作用(RR11＞RR01×RR10)。但 Logistic回归显示相乘交互作用系数IOR无统计学意义。此外，本研究发现相加交互系数也均无统计学意义。因此，根据本研究结果，尚不能认为XbaⅠ多态性、膳食大豆摄入存在生物学交互作用。目前，关于XbaⅠ多态性、膳食豆类摄入对乳腺癌风险影响的机制研究尚不成熟，后续深入的机制研究将有助于理解两者之间是否存在生物学交互效应及效应特点。此外，本次研究结果也不排除由于两者交互作用归因危险度较小，且本次研究样本量较局限，因此尚未观察到统计学交互效应。后续研究将扩大样本量进一步探讨二者的交互作用。

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