RP—HPLC法测定扁枝槲寄生中齐墩果酸的含量

王晓蓉??孙欢??刘胜兰??胡刚??秦雪

[摘要] 目的 建立测定扁枝槲寄生中齐墩果酸的RP-HPLC法。 方法 采用反相高效液相色谱法：Sepax Sapphire C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温17℃，流动相为乙腈-甲醇-0.05%醋酸铵（69∶12∶21），流速0.9mL/min，检测波长：210nm。 结果 齐墩果酸在1.2～2.4μg范围内与峰面积成良好线性关系（R2=0.9992），回收率为97.6%。 结论 本方法操作简便，测定结果准确、重现性好，可用于扁枝槲寄生药材及饮片的质量控制。

[关键词] 扁枝槲寄生；齐墩果酸；RP-HPLC

[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）17-51-03

RP-HPLC determination of oleanolic acid in viscum articulatum

WANG Xiaorong SUN Huan LIU Shenglan HU Gang QIN Xue

Panzhihua Institute for Food and Drug Control， Panzhihua， Sichuan， Panzhihua 617000， China

[Abstract] Objective To establish a determination method of oleanolic acid in Viscum articulatum by RP-HPLC. Methods The determination was carried out by RP-HPLC： The analytical column was Sepax Sapphire C18 （250mm×4.6mm， 5μm） and the column temperature was 17℃， it applied with acetonitrile-methyl alcohol-0.05% ammonium acetate （69∶12∶21） as the mobile phase， the flow rate was 0.9 mL/min， the UV detection wave length was 210nm. Results Oleanolic acid showed a good linearity in range of 1.2-2.4μg （R2=0.9992）， the average recovery was 97.6%. Conclusion The method is simple， the result is accurate and has a good reproducibility， it can be used to quality control of viscum articulatum.

[Key words] Viscum articulatum； Oleanolic acid； RP-HPLC

桑寄生科槲寄生属植物扁枝槲寄生Viscum articulatum Burm.f.，收载于《四川省中药材标准》[1]，其味苦，平，常用于祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎，与收载于《中国药典》的同属植物槲寄生具有同等功效[2]。目前关于它的化学成分研究较少，已见报道的有：黄酮类、三萜类及醇胺类等化合物[3-6]。有文献通过探究中药材中齐墩果酸与熊果酸的质控指标发现，很多以前认为仅含齐墩果酸或熊果酸一种成分的药材，经再研究证实实为同时含有齐墩果酸和熊果酸两种成分[7-8]，鉴于扁枝槲寄生的现行质量标准是采用薄层扫描法测定齐墩果酸的含量来评价，而至今尚无文献对其是否还含有熊果酸进行研究报道，且笔者按其质量标准进行薄层鉴别，发现此实验条件下无法分离齐墩果酸与熊果酸这一对性质相近的同分异构体，不能验证用薄层扫描法的斑点究竟是齐墩果酸的的单一组分还是与熊果酸的混合物，这直接影响了测定结果的准确性与可信度。故本实验旨在通过建立RP-HPLC法对扁枝槲寄生中齐墩果酸含量的测定，以期更准确、全面、客观的评价扁枝槲寄生的质量。现报道如下。

1 实验材料

1.1 仪器

waters 2695-2489高效液相色谱仪；XS205型电子天平。

1.2 试药、试剂

扁枝槲寄生：购自四川御鼎堂中药饮片有限公司。

对照品：齐墩果酸对照品（中国食品生物制品鉴定所，批号：110709-200505）、熊果酸对照品（中国食品生物制品鉴定所，批号：110742-200314）。

试剂：甲醇、乙腈为色谱纯，其他均为分析纯；水为双蒸水。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：sapphire C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-甲醇-0.05%醋酸铵（69∶12∶21）；流速：0.9mL/min；柱温：17℃；检测波长：210nm；进样量：10μL。

2.2 对照品溶液的制备

分别取齐墩果酸、熊果酸对照品适量，精密称定，置同一容量瓶中，加甲醇制成分别含0.15mg/mL

表1 加样回收试验结果

样品号 称样量（g） 齐墩果酸 熊果酸

加标量（mg） 回收率（%） RSD（%） 加标量（mg） 回收率（%） RSD（%）

1 1.0122 3.0124 97.23 0.73 2.0098 96.03 0.95

3.1118 98.16 2.1011 97.68

2 1.0458 2.9984 97.69 2.0346 97.23

3.0031 98.54 2.0755 96.17

3 0.9987 3.0752 96.39 1.9973 95.38

2.9876 97.07 2.1102 96.29

4 1.0264 3.0227 98.41 2.0458 96.72

3.1088 97.93 2.1215 95.04

5 1.0735 3.0450 97.52 2.0216 97.81

3.0663 96.77 2.0073 96.17

表2 重复性试验结果

样品号 称样量（g） 齐墩果酸 熊果酸

峰面积值 含量（%） RSD（%） 峰面积值 含量（%） RSD（%）

1 1.0122 1251858 0.601 1.31 / / /

1267175 0.609 / /

2 1.0458 1283653 0.597 / / /

1279874 0.595 / /

3 0.9987 1243668 0.605 / / /

1259211 0.609 / /

4 1.0264 1253893 0.594 / / /

1270770 0.602 / /

5 1.0735 1293756 0.586 / / /

1301183 0.589 / /

齐墩果酸、0.1mg/mL熊果酸的混合溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取扁枝槲寄生药材，粉碎过四号筛，再取药材粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25mL甲醇，密塞，称定重量，超声处理30min，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm滤膜，即得。

2.4 测定方法及含量计算

分别精密吸取混合对照品溶液及供试品溶液10μL，按上述色谱条件进样，按峰面积一点归依法计算含量。

3 实验方法的验证与结果

3.1 线性关系试验

分别精密吸取混合对照品溶液8、10、12、14、16?L，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分为纵坐标Y，含量为横坐标X，绘制标准曲线，得其线性回归方程与相关系数。齐墩果酸进样量在1.2～2.4μg的范围内线性关系良好（R2=0.9992），回归方程为：Y=542232X-17784；熊果酸进样量在0.8～1.6μg的范围内线性关系良好（R2=0.9995），回归方程为：Y=481249X-24189。

3.2 精密度试验

精密吸取上述混合对照品溶液10μL，按上述色谱条件，重复进样5次，测得齐墩果酸、熊果酸的峰面积值间的RSD分别为1.03%、1.27%，均≤3%。可见实验数据精密度良好，结果可靠。

3.3 稳定性试验

精密吸取上述混合对照品溶液10μL，于上述色谱条件下，分别在0、4、8、12、24h后进样，测得齐墩果酸、熊果酸的峰面积值间的RSD分别为1.39%、1.58%，均≤3%。可见混合对照品溶液在配制后24h内基本稳定，所得实验数据可靠。

3.4 加样回收试验

精密称取已知含量的扁枝槲寄生粉末1g，分别加入齐墩果酸、熊果酸对照品适量，按2.3项下供试品溶液的制备方法平行制备5份。测定峰面积，外标一点法计算含量，得出样品回收率及相对标准偏差（RSD），结果见表1。由表1可知，该实验方法回收率较高，达到实验要求，方法可靠。

3.5 重复性试验

按2.3项下方法平行制备供试品溶液5份，按上述色谱条件分别进样10μL，测定峰面积并计算含量与相对标准偏差（RSD），结果见表2。由表2可知：实验方法重现性良好，采用此方法考察扁枝槲寄生中齐墩果酸的含量可靠。

3.6 方法讨论

齐墩果酸与熊果酸同为五环三萜类化合物，仅E环上一个甲基的位置不同，性质极为相近，在中性流动相中均可解离，但很难分离，且柱温越高分离效果越差，笔者查阅文献[2，9-12]并经多次试验，最终选择乙腈-甲醇-0.05%醋酸铵（69∶12∶21）为流动相，柱温17℃。药材中齐墩果酸或熊果酸的提取方法常采用低极性溶剂直接提取或酸水解后再提取[7]，本实验用甲醇作为低极性溶剂考察了这两种方法，结果发现甲醇超声直接提取后虽然杂质峰较多但不干扰实验，且提取更充分，故样品的处理采用了甲醇直接超声提取；在检测波长的选择上，通过分别对齐墩果酸和熊果酸对照溶液于200～400nm波段进行波普扫描，最终实验选取210nm作为特征波长，这也与文献中大多采用205～220nm波段相一致[9-11]；在上述实验条件下，齐墩果酸与熊果酸能被检测出较强的吸收峰且峰型较好，分离度较高（R≥1.5），满足实验要求，见图1。

A

B

A：混合对照品；B：供试品

图1 RP-HPLC色谱图

4 小结

本实验建立的RP-HPLC法测定扁枝槲寄生中齐墩果酸含量的方法，采用齐墩果酸与熊果酸作双对照品，使测定结果更为准确可靠，由表2和图1可知：扁枝槲寄生中未检出熊果酸，这可能与该成分的含量太低或样品处理有关。按照《四川省中药材》[1]中扁枝槲寄生的质量标准，本研究对同一批扁枝槲寄生药材进行齐墩果酸的薄层扫描含量测定，测得结果为0.417%，与本实验所得结果有所差距，分析原因，这可能与薄层扫描法中为了排除杂质斑点的干扰而进行的诸如萃取、过柱洗脱等复杂的纯化手段使待测物质流失有关，且还受薄层板、显色等诸多因素的影响。本实验方法不仅灵敏度、重现性与准确度大大高于薄层扫描法，且样品处理过程简单，提取更充分，为扁枝槲寄生的质量控制提供了更可靠有效的方法保证与科学依据。

[参考文献]

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（收稿日期：2015-04-07）