呋柳擦剂微生物限度检查方法研究

杨静??尹娜娜??苗爱东

[摘要] 目的 建立呋柳擦剂的微生物限度检查方法。 方法 制备供试液时加入了聚山梨酯80，并与未加聚山梨酯80供试液的验证结果相比较。 结果 未加聚山梨酯80的供试液存在抑菌活性，而加入15g聚山梨酯80的供试液，采用培养基稀释法各试验菌的回收率均>70%。 结论 呋柳擦剂可采用加入聚山梨酯80的供试液制备方法进行微生物限度检查。

[关键词] 呋柳擦剂；聚山梨酯80；微生物限度检查；方法验证

[中图分类号] R927.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）17-48-03

Research on test methods of microorganism limit of Fu Liu liniment

YANG Jing YIN Nana MIAO Aidong

Beijing Military Region Joint Logistics Department Drug and Instrument Test Institute，Beijing 100071，China

[Abstract] Objective Establish microorganism limit test of Fu Liu Liniment. Methods Add Polysorbate 80 when preparing test solution，and compare the test result with the test solution without Polysorbate 80. Results Antibacterial activities appeared in the test solution without Polysorbate 80，but for the one with 15g Polysorbate 80，the recovery rate of every tested microorganisms is larger than 70%. Conclution We can conduct microorganism limit test of Fu Liu Liniment by adding Polysorbate 80.

[Key words] Fu Liu liniment；Polysorbate 80；Microorganism limit test；Method validation

呋柳擦剂为皮肤病外用制剂，由水杨酸、苯甲酸、鞣酸和呋喃西林等成分组成，本品具有抑制真菌、止痒等作用，主要用于手足癣和体癣等各种皮肤癣症的治疗。按常规方法制备供试液时，制剂中的主要化学成分存在明显的抑菌活性，难以确保试验结果的可靠性[1-5]。供试品加入15g聚山梨酯80混匀后再加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制备的供试液为澄清的液体，采用培养基稀释法各试验菌的回收率均大于70%。现将结果报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HTY-2000 集菌仪（杭州泰林医疗器械厂）；GH-6000隔水式培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）；LRH-250-MS霉菌培养箱（韶关泰宏医疗器械有限公司）；DF3-3红外线高温干燥箱（北京兴争仪器设备厂）；LDZX立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

1.2 菌种

验证用试验菌种均购于中国药品生物制品检定所，包括：大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。

1.3 培养基

玫瑰红钠琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基、改良马丁培养基、胆盐乳糖培养基、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号分别为1312192、131218、131016、120113、1309122、140110、140124）均购于中国药品生物制品检定所；聚山梨酯80（上海申宇医药化工有限公司）；呋柳擦剂（批号：20120917、20130312、20130313）。

2 试验方法与结果

按照《中国药典》2010年版，第一部[4]附录XⅢ C微生物限度检查法进行验证试验。

2.1 菌液制备

2.1.1 将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌，分别接种至10mL营养肉汤培养基中，35℃培养24h，分别取上述培养物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，制成每1mL含菌数约为50～100cfu的菌液，备用。用于控制菌检查时，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，制成每1mL含菌数约为10～100cfu的菌液，备用。

2.1.2 将白色念珠菌接种至10mL改良马丁培养基中，25℃培养24h，取上述培养物1mL，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，制成每1mL含菌数约为50～100cfu的菌液，备用。

表1 常规法的回收率试验结果（%）

组别 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽胞杆菌 白色念珠菌 黑曲霉

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

A组 61 60 64 23 24 26 0 0 0 92 91 90 87 90 85

B组 98 90 93 100 103 99 28 29 26 92 93 95 90 93 92

C组 98 100 102 100 100 96 98 96 100 100 99 100 95 100 100

表2 培养基稀释法的回收率试验结果（%）

组别 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽胞菌 白色念珠菌

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

A组 96 90 94 23 25 26 0 0 0

57 55 60 0 0 0

B组 88 80 86

2.1.3 将黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，25℃培养5～7d，有大量的孢子产生，加入5mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管中，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，制成含菌数约为50～100cfu/mL的孢子悬液，备用。

2.2 供试液的制备

A组：取呋柳擦剂10mL，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，制成1∶10的供试液；B组：取呋柳擦剂10mL，加入15g聚山梨酯80混匀后再加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，制成1∶10的供试液；C组：取15g聚山梨酯80加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，摇匀，作为稀释剂对照组。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证

2.3.1 试验组 （1）常规法：取1mL供试液和50～100cfu试验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL营养琼脂培养基，摇匀、培养、观察结果。（2）培养基稀释法：分别取0.5和0.2mL的供试液和50～100cfu试验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL 营养琼脂培养基，摇匀、培养、观察结果。各试验菌株的回收率结果，见表l。

2.3.2 菌液组 取50～100cfu试验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL营养琼脂培养基，摇匀、培养、观察结果。

2.3.3 供试品对照组 （1）常规法：取1mL供试液，注入平皿中，每皿加15～20mL营养琼脂培养基，摇匀、培养、观察结果。（2）培养基稀释法：分别取0.5和0.2mL的供试液，注入平皿中，每皿加15～20mL 营养琼脂培养基，摇匀、培养、观察结果。

2.3.4 稀释剂对照组 （1）常规法：取1Ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和50～100cfu试验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL营养琼脂培养基，摇匀、培养、观察结果。（2）培养基稀释法：分别取0.5和0.2mL的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和50～100cfu试验菌，注入平皿中，每皿加15～20mL l营养琼脂培养基，摇匀、培养、观察结果。

2.3.5 试验组回收率（%）=[（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数]×100%。

从表1的回收率试验结果可以看出：采用常规法，A组对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的回收率均<70%，对枯草芽胞杆菌的回收率为0，说明制剂中的成分有显著的抑菌作用。B组仅对枯草芽胞杆菌的回收率<70%，因此，先选择培养基稀释法测定各抑菌菌株的回收率，见表2。

从表2的回收率试验结果可以看出：A组采用0.2mL皿供试液的培养基稀释法后，对金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌的回收率仍低于70%。B组采用0.5mL/皿供试液的培养基稀释法后，对枯草芽胞杆菌的回收率即达到了70%，说明加入的15g聚山梨酯80 起到了中和抑菌性的作用。

2.4 控制菌检查方法的验证

呋柳擦剂为外用溶液剂，按照《中国药典》2010年版，第二部[6]规定，控制菌应检查金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。

2.4.1 金黄色葡萄球菌 试验组：（1）常规法：取1∶10的供试液10mL和含菌数约为10～100cfu的金黄色葡萄球菌，加入到100mL营养肉汤培养基中。（2）培养基稀释法：取1∶10的供试液10mL和金黄色葡萄球菌10～100cfu，加入到200 mL营养肉汤培养基中。

供试品组：除不加金黄色葡萄球菌外，其余操作同试验组。

阳性对照组：除不加供试液外，其余操作同试验组。

阴性对照组：用稀释液代替供试液，其余操作同试验组。

2.4.2 铜绿假单胞菌 试验组：（1）常规法：取1∶10的供试液10mL和含菌数约为10～100cfu的铜绿假单胞菌，加入到100mL胆盐乳糖培养基中。（2）培养基稀释法：取1∶10的供试液10mL和铜绿假单胞菌10～100cfu，加入到200mL胆盐乳糖培养基中。

供试品组：除不加铜绿假单胞菌外，其余操作同试验组。

阳性对照组：除不加供试液外，其余操作同试验组。

阴性对照组：用稀释液代替供试液，其余操作同试验组。控制菌检查方法的验证结果，见表3。

表3 控制菌检查方法的验证结果

药品名称 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌

常规法 稀释法 常规法 稀释法

A组 - - - +

B组 - + + /

注：表中“+”代表该反应呈阳性，“-”代表该反应呈阴性。

2.5 微生物限度检查方法的验证结果

2.5.1 计数方法的验证结果 通过验证试验，采用0.5mL/皿供试液的培养基稀释法即能有效去除其抑菌作用，使回收率均达到70%以上。

2.5.2 控制菌检查方法的验证结果 呋柳擦剂采用培养基稀释法检查金黄色葡萄球菌，采用常规法检查铜绿假单胞菌。

3 讨论

呋柳擦剂含水杨酸、苯甲酸、鞣酸和呋喃西林等成分，在10mL供试品中直接加入稀释剂制成的供试液，对试验菌有较强的抑菌性。当制备供试液时先将10mL供试品与15g聚山梨酯80混合后，再加入稀释剂制成的供试液，能有效去除其抑菌作用，方法简单、快速，节约成本，科学可靠。聚山梨酯80是非离子型表面活性剂，具有乳化、增溶和稳定的作用，一方面增加了药品的溶解性，另一方面对微生物有保护作用[7-11]，通过试验证明，聚山梨酯80对试验菌株无抑菌性，不会对微生物造成损伤[12-16]。在供试品中添加聚山梨酯80可有效地降低其抑菌性，但由于不同的供试品抑菌性不同，抑菌性强需要其浓度高，可在试验中适当调节。试验中发现，在制备供试液时应充分摇匀，使供试品在稀释剂中分散均匀，确保试验的重复性和可靠性。

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（收稿日期：2015-07-10）