冬虫夏草特异性PCR鉴定方法研究

张喜库 刘桐辉

吉化集团公司总医院药剂科，吉林吉林 132022

冬虫夏草特异性PCR鉴定方法研究

张喜库 刘桐辉

吉化集团公司总医院药剂科，吉林吉林 132022

目的 建立一种准确、简便的方法鉴别冬虫夏草真伪。 方法 采用改良CTAB法从冬虫夏草样品中提取总DNA，根据rDNA中ITS1区序列设计一对特异性引物，对虫草样品进行特异性扩增。 结果 冬虫夏草标准品和部分市售虫草样品能扩增出255bp大小的目的片段，其余虫草样品未能扩增出相应条带。 结论改良CTAB法提取DNA所需时间短对DNA分子破坏性小。特异PCR鉴别冬虫夏草真伪的方法准确快捷，对珍贵药材的甄别具有广阔的前景。

冬虫夏草；改良CTAB法；PCR

本品为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体[1]，俗称虫草。其主要产于西藏、青海、云南、四川等高海拔地区，以丰满肥大，外色黄亮，内部色白者为佳[2-3]。《本草丛新》中记载冬虫夏草性温味甘，具有补虚损、益精气、化痰止咳的功效，与人参、鹿茸齐名并誉为中国的三大补药[4-5]。中医常用于久咳虚喘，产后虚弱、阳痿阴冷等“虚”的病症[5-6]，是我国名贵的中药材。虫草所含化学成分丰富，特别是虫草多糖，可通过影响细胞的增殖、分化及分泌，提高细胞免疫和体液免疫功能，增强人体免疫力，进而发挥抗肿瘤作用[7-10]。虫草中的蛋白质、氨基酸以及30余种微量元素是改善心脑血管功能、降低血糖的必要成分[7-13]。由于冬虫夏草功效独特，且人工抚育技术尚未成熟，原材料供不应求，市场上也常常出现人工伪制虫草以次充好的现象，致使药源市场上鱼龙混杂、真假难辨。因此，准确鉴别冬虫夏草的真伪具有十分重要的意义。本文借鉴前人对冬虫夏草的研究，建立了一种快速简便、准确灵敏的鉴别方法，为虫草的甄别提供新的科学依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

冬虫夏草标准品（中国食品药品检定研究，批号201103）；蛹虫草（吉林省食品药品检验所鉴定）；人工伪制虫草（吉林省食品药品检验所鉴定）；待测样品购于吉林市各大药店。

1.2主要化学试剂

2×CTAB[2% CTAB 2g，1.4mol/L NaCl 8.18g，20mmol/L EDTA 0.74g，0.1mol/L Tris-Hcl（pH 8.0）10mL，0.3% β-巯基乙醇 0.2mL]、dNTPs（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）、10×PCR Buffer（北京天根生化科技有限公司）、Taq 酶（北京天根生化科技有限公司）、10×Loading Buffer（北京天根生化科技有限公司）、DNA Ladder （北京天根生化科技有限公司），琼脂糖凝胶粉（England），PCR引物由生工生物（上海）有限公司合成。其他化学试剂均为国产分析纯，无菌双蒸水（自制）。

1.3仪器

H-2050R型台式低温高速离心机（美国Becman公司）；梯度PCR热循环仪（郑州博邦科贸有限公司）；DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；电子分析天平（上海良平仪器仪表有限公司）；紫外分光光度计（上海分析仪器厂）；电热恒温水浴锅（济南德瑞克仪器有限公司）；-20℃冰箱（北京福意电器有限公司）。

2　方法

2.1样品前处理[14]

取冬虫夏草干品用双蒸水刷净，浸于75%的酒精中1min，37℃烘干后，放入研钵中研磨成粉。

2.2模板DNA的提取[15-17]

称取冬虫夏草粉末0.1g置于离心管中， 加入预热后2×CTAB 300μL混匀，65℃水浴振荡2h。4 ℃下，10000r/min离心10 min，吸取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1）抽提1次。加入等体积预冷的异丙醇，-20℃放置1h。10000r/min离心10min，弃上清液。沉淀物用适量70% 乙醇洗涤，10000r/min离心5min，弃上清液。室温干燥沉淀，加入80μL TE溶液溶解DNA，-20℃保存备用。

2.3DNA的纯度、浓度检测[18]

将DNA模板液适当稀释后，用紫外分光光度计测定260、280nm处各样品的吸光度A260和A280，以A260/A280 的比值计算DNA的纯度及浓度。

2.4特异性引物设计及PCR扩增反应

从GenBank中查寻冬虫夏草的DNA序列（KC437356），通过Premier 5.0设计特异引物，并对设计的引物进行评估[19-20]，最终确定特异性引物序列（上游引物：5’GAGCATCGTACGTACCAT 3’,下游引物：3’CGCTCGTACCTGAATA 5’），送由上海生工完成引物合成。

PCR反应体系为30μL[21]：10×PCR buffer（含Mg2+） 3.0μL，dNTPs（2.5mmol/L） 2.4μL，上、下游引物各1μL，Tap DNA聚合酶（5U/μL） 1μL，2μLDNA模板（100ng/μL）。

PCR扩增条件为[22]：94℃预变性5min，94℃变性30sec，56℃退火45sec，72℃延伸50sec，35个循环后72℃延伸10min。

2.5PCR产物检测[19]

PCR产物与10×Loading buffer（10∶1）溶液混匀点样于2%琼脂糖凝胶板上，电压75V，电泳40min，经紫外检测拍照。

3　结果与分析

3.1DNA纯度及浓度检测结果

CTAB法提取样板DNA的纯度在（1.80±0.23）之间，见表1。结果表明：改良CTAB法提取的DNA样品纯度高、无蛋白质污染。

表1　冬虫夏草及待测样品的纯度和浓度检测结果

3.2PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱

经PCR特异性扩增后，仅冬虫夏草标准品、市售虫草3号与引物存在特异性结合位点，可在255bp处扩增出亮度不同的阳性条带。蛹虫草、人工伪制虫草均无相应条带出现，市售虫草样品1、2、4号也无扩增条带，且空白对照无污染，见图1。结果表明：除冬虫夏草标准品与市售虫草3号为正品外，其余皆为伪品冬虫夏草，此实验结果与吉林省药检所鉴定结果相同。

图1　冬虫夏草样品PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱

4　讨论

冬虫夏草中富含较多的蛋白质、多酚、脂类等干扰DNA提取的物质。常规CTAB法所获得的DNA模板中除蛋白质含量较高外，还会混有多酚氧化的褐色物等，难以获得高纯度的DNA，从而影响到后续试验（如酶切， PCR扩增反应等）的进行。作者总结前人经验，对常规CTAB法进行了如下改进：（1）由于虫草样品多为干品，因此适当增加β-巯基乙醇的用量，可减少组织的褐变；（2）在CTAB 缓冲液中加入EDTA和异丙醇，可沉淀大量杂质，提高DNA 的纯度；（3）将氯仿-异戊醇（24∶1）抽提减少为1次，减少了有毒化学试剂对人体的伤害和对环境污染，同时也简化操作步骤，大大节省了实验时间。改良CTAB法提取DNA纯度在1.67～1.89之间，减少了蛋白质对DNA模板的污染，为接下来的聚合酶链式反应提供了保障。

选择适宜的退火温度可以提高扩增反应的特异性，获得理想的条带。若退火温度过低，引物可与非特定靶位点结合，产生非目的DNA片段，出现假阳性；若退火温度过高，扩增结果的特异性会很强，但同时也会影响引物与模板的结合，导致扩增效率大大降低。经过反复摸索，当退火温度为56℃时，得到的条带最为稳定，特异性最强。因此，本实验选定退火温度为56℃。

实验表明，本实验所建立的方法特异性强、灵敏度高、操作简单、所需样品量少，由于本方法利用虫草DNA的序列特征，从分子水平上鉴别虫草的真伪，具有很高的准确性和很强的通用性。此次试验只选用吉林地区的市售虫草作为样品，日后打算扩展研究样品数量，采集各地区的市售虫草进行实验，进一步验证此方法的准确性。

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Studies on identification method by PCR of specificity of aweto

ZHANG Xiku LIU Tonghui
Department of Pharmacy, General Hospital of Jihua Group Corporation, Jilin 132022, China

Objective To establish an accurate and convenient method to identify aweto. Methods The modified CTAB method was used to extract genomic DNA from samples of the aweto. These samples were specifically amplified by a pair of specific primers which was designed according to ITS1 sequence of rDNA. Results 255bp target fragment could be amplified by the standard aweto and parts of samples of commercial aweto while other samples couldn't. Conclusion Modified CTAB method is a good way to extract DNA from aweto with shorter time and less destructive effects on DNA molecular. Specific PCR method is accurate and fast in the identification of aweto, which has wide prospects in identification of precious herbs.

Aweto; Modified CTAB method; PCR

R282.5

B

2095-0616（2015）09-55-03

（2015-03-04）