中草药提取物对鸡源双歧杆菌体外发酵的影响研究

蔡玉华，胥振国

(合肥职业技术学院，安徽 合肥 238000）

随着改革开放和人们生活水平的提高，我国的畜牧业有了快速的发展，这与抗生素引入到禽畜牧业中也有密切的关系，自从人们发现抗生素有促进禽类畜类生长的作用后，就将其作为饲料添加剂应用于促进动物生长、预防动物疾病等当中。但是随之而来的是，滥用抗生素破坏了动物体内原有的菌群，抑制了一些有益菌的生长，并使一些有害菌产生了耐药性。因此，新型饲料添加剂益生元制剂便相继产生，它正付合人们对緑色食品的追求并已显示了良好的发展前景。

益生元制剂是一类可以促进有益菌增殖的物质，目前用于益生元制剂的有以下几种物质:有益微生物代谢产物、能产生益生素的活菌、中草药制剂，最早发现的是双歧因子，后来又发现了不能被宿主细胞消化的寡糖。佳木斯大学微生态协作组在杨景云教授的带领下晒筛选出人参、党参、灵芝、黄芪、五味子、茯苓、枸杞子等多种药材，都具有明显的益生因子作用[1]。据报道[2]2008年12月我国农业部1126号公告《饲料添加剂品种目录》中规定的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种，共16种，主要有双歧杆菌、植物乳酸杆菌、乳酸球菌、枯草芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌等。

其中双歧杆菌(Bifidobacterium)是法国巴斯德研究院的Tissier在1899年首先在母乳喂养的健康婴儿粪便中发现并分离出来的专性厌氧菌[3]。目前有众多文献报道双歧杆菌有多种生理功能[4]:维护肠道菌群平衡，阻止有害菌的入侵，抗肿瘤，提高免疫力，延缓衰老等等。

因此，根据前人的研究，以筛选的几种中草药为主，将其添加到双歧杆菌的培养液中，研究其对双歧杆菌的发酵影响，以期获得新型饲料添加剂——微生物与中草药合剂。

1 材料与方法

1.1 菌种

双歧杆菌S7由安徽农业大学微生物检验实验室从鸡回肠内容物中筛选出并保存。

1.2 培养基

MRS 固体培养基(计数培养基)[5]:蛋白胨 10.0g，牛肉浸取物 10.0g，酵母浸出膏 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，无水乙酸钠 5.0 g，柠檬酸二胺 2.0 g，Tween801.0mL，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，CaCO320.0 g，琼脂 15.0 g，蒸馏水 1.0L，调 pH 6.8。

MRS 液体培养基(活化培养基)[5]:蛋白胨 10.0g，牛肉浸取物 10.0g，酵母浸出膏 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，无水乙酸钠 5.0 g，柠檬酸二胺 2.0 g，Tween801.0mL，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，CaCO320.0 g，蒸馏水 1.0L，调 pH 6.8。

1.3 中草药

陈皮、山药、枸杞天然药食通用植物原料，购于巢湖市康复大药房。

1.4 菌种的活化

将半固体MRS培养基中的保存的双歧杆菌用无菌接种针插入后取出，后将接种针插入250mL的三角烧瓶装有100mL的MRS液体培养基中，在37℃，120r/min下恒温振荡培养24h。然后以4%的接种量将活化的种子液接种于250mL的三角烧瓶装有100mL的MRS液体培养基中进一步活化[5]。

1.5 中草药提取液的制备

采用水煎法:取中药10g，先将药材切成碎片或粉末，加3～8倍的水，浸泡2～4h，煮沸后用纹火持续20～30min(视药物而定);滤出煎液，加3～5倍的水，进行二煎(20～30min);滤出煎液，加2～4倍的水，进行三煎(20～30min)，合并滤液，继续加热，使其浓缩至100mL，4000转/分，离心10min，取上清液，115℃高压蒸汽灭菌30min，4℃冰箱保存备用。

1.6 试验设计与测定方法

本试验将各种中草药提取液按0mL/100mL(0%)、2mL/100mL(2%)、4mL/100mL(4%)三种梯度接种于含双歧杆菌的基础培养基中进行体外发酵，每处理3个重复，37℃下进行培养，分别于Oh、12h、24h、36h四个时间点后，使用移液管每次取5mL发酵液于10mL离心管中，应用pH计与乳酸测定生化试剂盒分别测定pH值与乳酸浓度[6]，同时通过平板计数法来比较各组双歧杆菌的生长情况 。

1.7 统计学分析

实验数据经Excel处理后，采用简明统计软件进行方差分析[7]，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 三种中草药粗提液不同添加水平对双歧杆菌生长的影响

由下表1可知，添加不同中草药提取液不同水平均对鸡源双歧杆菌的生长产生明显影响，其中针对同一种中草药提取液，不同的添加浓度，相同培养时间，添加组比对照组，活菌浓度明显增多，即每列小写字母不同，表示差异显著。从表1可确定，陈皮的最佳添加浓度为2%，培养时间24h后活菌数达到最高13.38±0.12(×108CFU/mL);山药的添加浓度2%或者4%，差异不明显，培养时间为24h后达到最高11.63±0.03(×108FU/mL);枸杞的最佳添加浓度为2%，培养时间24h后达到最高10.37±0.18(×108FU/mL)。

表1 不同中草药提取液不同水平对双歧杆菌生长的影响Table 1 Effects of Chinese herb extracts at different levels on bifidobacteria growth

2.2 三种中草药粗提液不同添加水平对双歧杆菌培养液中乳酸浓度的影响

由下表2可知，添加不同中草药提取液不同水平均对双歧杆菌发酵产乳酸量有一定的影响，其中针对同一种中草药提取液，不同的添加浓度，相同培养时间，添加组比对照组，乳酸浓度明显提高，即每列小写字母不同，表示差异显著。从表2可确定，陈皮在添加量为2%时，培养24h后乳酸浓度达到最高为17.89±0.47mmol/L，山药在4%添加量，培养24h后乳酸浓度达到最高为16.89±0.53 mmol/L，枸杞在2%添加量，培养24h后乳酸浓度达到最高为16.40±0.55 mmol/L。从表2还可以看出开始随着培养时间的延长乳酸浓度逐渐增加，但到24h后，继续培养，乳酸浓度反而下降。

表2 不同中草药提取液不同水平对培养液中乳酸浓度的影响Table 2 Effects of Chinese herb extracts at different levels on lactate concentration in the culture medium

3 讨论

陈皮(Pericarpium Citri Reticulatae)又称橘皮，为芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)。陈皮富含多种生物体生长所需要的成分如粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、多种氨基酸、矿物质元素。目前，有众多文献报道，陈皮有升高血压，抗血小板聚集，提高离体唾液淀粉酶活性，抗霉菌活性，抗氧化抗衰老作用[8]。有研究表明，作为新型饲料添加剂的益生元，合生元能够改变动物体内菌群生活，主要表现在两个方面，一是增加肠道内有益菌的生长，如乳酸杆菌，双歧杆菌;二是抑制致病菌的生长，如大肠杆菌，沙门氏菌;在饲料中添加陈皮可以提高AA白羽肉鸡20日龄时盲肠乳酸菌的数量及比例[9]。因此，本文研究了将陈皮作为中草药添加剂加入到双歧杆菌的培养液中，研究其对双歧杆菌发酵的影响，结果表明，在添加2%的陈皮提取液时，发酵24h后，双歧杆菌数量13.38±0.12(×108CFU/mL)明显高于未添加组的 9.39±0.14(×108CFU/mL);另外，在发酵24h后，添加组中乳酸浓度为17.89±0.47mmol/L明显高于未添加组的13.26±0.31mmol/L，说明了陈皮作为中草药的一种，其所含营养成分能够提高双歧杆菌的活性，并有利于产生生物活性物质。

山药(Dioscorea opposite Thunb)原植物名为薯蓣，为薯蓣科薯蓣属植物，现代科学研究已明确[10－11]，山药块茎营养丰富，其含多种糖类、蛋白质、脂肪、维生素、微量元素、氨基酸等。山药的药用价值有调节或增加免疫功能，调整或促进肠胃功能，调整或降低血糖、血脂抗衰老抗肿瘤功能。山药为当今世界绿色食品之王，有天然人参之美称。本文研究了将山药提取液加入双歧杆菌的培养液中，研究其对有益菌双歧杆菌的影响，结果表明，在添加2%或者4%的山药提取液时，发酵24h后，双歧杆菌数量，明显高于未添加组;添加组乳酸含量也明显增高。

枸杞(Lycium barbarum)是茄目茄科枸杞属的植物，果实称枸杞子，嫩叶称枸杞头。现代药理学研究证实枸杞子可调节机体免疫功能、能有效抑制肿瘤生长和细胞突变、具有延缓衰老、抗脂肪肝、调节血脂和血糖、促进造血功能等方面的作用，并应用于临床。本研究通过将枸杞浸提物添加到含双歧杆菌的培养液中，发现俩种添加浓度对不同培养时间的双歧杆菌活菌数与对照组相比都有提高，在2%添加量培养24h后，活菌数量及乳酸产量均为最高，说明枸杞浸提物对双歧杆菌具有显著的促生作用，这与张火云[12]报道了枸杞浸提物对双歧杆菌具有促生作用相一致。

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