辣椒炭疽病原菌生物学特性研究

程勋东，隋益虎

(安徽科技学院 生命科学学院，安徽 凤阳 233100）

辣椒(Capsicum spp.)种植面积居我国蔬菜作物第二位，是市场上最为常见的蔬菜之一[1]。常见辣椒病害主要有炭疽病、疫病、病毒病等[2]，尤其炎热潮湿的气候条件有利炭疽病发生，发病后会造成大量落叶和烂果，通常减产20% ～50%，严重影响辣椒商品性[3]。据报道各地辣椒炭疽病致病的病原菌有一定的差异，主要有辣椒丛刺盘孢菌(Vermicularia capsici Syd)、辣椒盘长孢菌(G.piperatum Ell.et EV)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)等[4]，本研究通过对本地辣椒炭疽菌进行初步鉴定，并进行生物特性研究，为辣椒果实炭疽病的栽培预防及防治提供基础性资料，以期提高辣椒果实质量。

1 材料与方法

1.1 试验材料

表现为典型炭疽病症状的辣椒果实取自安徽科技学院种植科技园3号温室。

1.2 病原菌的分离和纯化

首先将试验材料用自来水将表面的泥渍等洗净后晾干，接着用70%的酒精进行表面消毒30 s，然后用0.1%的氯化汞将材料消毒6 min，迅速用灭菌水冲洗3次。用手术刀片于果实表面切口，用接种针挑取内部病害部位病原菌接种至PDA培养基(组份为葡糖糖20 g、琼脂20 g、去皮土豆200 g，蒸馏水1000 mL，煮沸30 min，自然pH值)，28℃恒温培养箱中培养3～4 d。观察培养皿中各菌落的生长状况，包括菌落的大小、形状、颜色等形态特征，挑取单菌落在培养基上28℃进行纯培养，并将各菌株划线纯培养于PDA试管斜面保存，为下列试验提供原始菌株。

1.3 病原菌产孢诱导及鉴定

为了鉴定材料中分离得到的病原菌，首先对其诱导产孢，根据唐景美[5]等对辣椒炭疽病菌生物学特性以及分生孢子的特性研究，设计了几种诱导产孢的方法(如表1)，其中PDA+辣椒培养基为上述PDA培养基中添加辣椒叶片50 g。待菌落产孢后，观察菌落的形态特征，并利用数码显微镜(Motic，BA210)观察孢子和孢子梗的形态特点并拍照，进行病原菌初步鉴定。

表1 促进病原菌产孢的处理方式Table 1 Treatment combinations of inducing pathogen to spore

1.4 温度对病原菌菌丝生长影响

将直径为4 mm的菌龄相同生长旺盛的菌饼无菌操作转移到PDA培养基平板的中央，分别置于15、20、25、30、35和40℃温度梯度下连续培养，每种处理3次重复。5 d后采用十字相交的方式测量各菌落的直径并计算3次重复的平均值。比较不同温度条件下病原菌菌丝生长速率。

1.5 培养基成分对病原菌菌丝生长影响

将大蒜、芥菜、小白菜、番茄、辣椒5种不同种类蔬菜的叶片洗净晾干后各自称取5 g，分别与土豆20 g，葡糖糖2 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL制成相应的PDA复合培养基，对照培养基成分为土豆25 g(去皮)，葡糖糖2 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL。将直径为4 mm菌龄相同生长旺盛的菌饼无菌操作转移到6种不同成分培养基平板的中央，置于28℃条件下连续培养，每种处理3次重复，菌落直径测量方法同上。比较含不同种类蔬菜成分的培养基中病原菌菌丝生长速率。

取紫色辣椒7036、9007－1、1127、1121P －3和绿色辣椒1123G －3、1126－2、1116－2、111SL －1共8种不同品种的辣椒叶片洗净晾干，利用隋益虎等[6]紫色辣椒叶片色素的优化提取方法，比较不同品种辣椒叶片色素的相对含量。将8个品种的辣椒叶片洗净晾干后各称取5 g，分别与土豆20 g(去皮)，葡糖糖2g，琼脂2g，蒸馏水100 mL，制成相应的PDA复合培养基。以含25 g去皮土豆的PDA培养基为对照培养基。将直径4 mm菌龄相同生长旺盛的菌饼菌丝面朝下无菌操作转移到6种含有不同辣椒叶片成分的培养基中央，置于28℃条件下连续培养，每种处理3次重复，菌落直径测量方法同上。比较含不同品种辣椒成分培养基中病原菌菌丝生长速率。

1.6 光照条件对病原菌菌丝生长影响

将直径为4 mm的菌龄相同生长旺盛的菌饼菌丝面朝下无菌操作转移到PDA培养基中央，分别置于24 h完全光照、12 h光暗交替、24 h完全黑暗3种光照条件28℃条件下连续培养，每种处理3次重复，菌落直径测量方法同上。比较不同光照条件下病原菌菌丝生长速率。

1.7 数据分析

所得的数据均采用Microsoft Excel 2003进行方差分析和SPSS 16.0进行单因素多重比较处理。

2 结果与分析

2.1 病原菌诱导产孢及鉴定

经过分离纯化的病原菌在PDA培养基平板上培养5 d后，观察可知各菌落形态基本一致，菌落直径约为66.67 mm，边缘较圆整，菌落呈同心圆形状，生长初期菌丝为白色，后期变为灰白色至浅褐色(图1)。诱导产孢试验表明，病原菌在PDA培养基上正常培养不产孢子或产生极少量孢子，在光暗交替以及先低温后高温培养下能促进产孢，而其他处理组均未观察到明显的孢子产生。可能是因为不利的温光环境条件或不当的营养元素比例，能促进该病原菌产生孢子。

显微镜下观察病原菌分生孢子和孢子梗的特征，分生孢子呈圆柱状，无色，部分孢子两端为弧形，部分孢子一端尖一端弧形，孢子梗直立呈短圆柱形，具有2～4个隔膜(图2)。根据这些病原菌的形态特征，参考郑建秋[7]、吴文平[4]和陆家云[8]等的描述，初步鉴定可知分离纯化的病原菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。

2.2 温度对病原菌生长的影响

在所设置的6种温度条件下连续培养5 d发现，在15～35℃范围内病原菌菌丝均能生长。但是不同的温度条件下，菌落直径大小各不相同。在15～25℃范围内，菌落直径和温度高低呈正相关关系;在25～35℃范围内，菌落直径和温度高低呈负相关关系;40℃高温对该菌菌丝的生长有明显的抑制作用;25℃时菌落直径最大。可知6个温度梯度中，25℃为该病原菌的最适生长温度，最适温度范围为25～30℃，而菌丝能否生长的高温临界温度在35～40℃之间(表2)。

表2 不同温度条件下炭疽菌落的直径Table 2 Diameter of the colony under the different temperature gradient

2.3 培养基对病原菌生长的影响

2.3.1 不同种类蔬菜成分对病原菌生长的影响 供试的含有不同蔬菜成分的PDA固体培养基上，该病原菌在含有芥菜和大蒜叶片成分的培养基中菌落直径最小，与含有辣椒、小白菜和番茄3种叶片成分的培养基上的菌落直径相比有显著差异;在含有大蒜成分的培养基上生长状况显著差于在含有其他4种成分培养基上的生长状况;而含有辣椒、小白菜、番茄叶片成分的培养基与对照培养基的生长状况没有显著差异(表3)。

表3 含有不同蔬菜叶片成分的培养基中菌落的直径Table 3 Diameter of the colony growing in the PDA－based culture medium supplemented with different composition of various vegetables

2.3.2 不同品种辣椒成分对病原菌生长的影响 叶片色素的吸光度值测定表明，不同品种的辣椒中色素含量差别很大，紫色辣椒花青素含量较普通绿色辣椒高，但含有不同辣椒叶片成分的培养基中，病原菌菌丝均能够正常生长，培养5 d后菌落直径没有显著差异，各处理菌落的形态较为一致(表4)。

表4 含有不同花青素成分的辣椒品种培养基中菌落的直径Table 4 Diameter of the colony growing in the PDA－based culture medium supplemented with different content of anthocyanin in chilli pepper varieties

2.4 光照对病原菌生长的影响

在不同的光照条件下，病原菌菌丝均能够生长，各处理菌落直径和菌丝颜色较为一致。24h完全光照、12h光暗交替和 24h完全黑暗处理菌落直径分别为 67.50 ±2.12、66.67 ±1.53和 66.00 ±2.00(mm)，方差分析表明3种光照处理下菌落直径大小无显著性差异，可见病原菌菌丝的生长不受光照条件的影响。

3 结论与讨论

通过对辣椒炭疽病果实中分离得到的病原菌诱导产孢，根据形态学特征对其进行初步鉴定。结果表明经分离纯化得到的菌株均为胶孢炭疽菌，该病原菌在28℃下培养仅能产生少量的孢子，而在光暗交替或者冷热交替条件下培养，能产生大量的孢子。病原菌菌丝的生长不受光照条件的影响。

温度在15～35℃之间病原菌菌丝均可以生长，在25～30℃之间菌丝生长速率相较其它培养温度最快，25℃时速率最大即为最适温度，35～40℃为菌丝生长高温临界温度。该试验结果和张海英等[9]对引起草莓上胶孢炭疽病以及范晓龙等[10]对红豆杉上的胶孢炭疽菌的研究结果基本一致。由于试验当中温度梯度范围有限，只获得该病原菌的最适生长温度范围和高温临界温度范围，可通过在25～30℃之间以及15℃以下设置系列浓度梯度，以更精确地获知该病原菌的生长最适温度和低温临界温度。

试验发现大蒜和芥菜对胶孢炭疽菌生长均有较强的抑制作用。有研究[11－13]表明大蒜中含有大蒜素，它是由大蒜体内的大蒜酶催化大蒜氨酸转化产生，具有强烈的刺激性气味，有较强的抗菌消炎作用，能够抑制或杀灭多种病菌。芥菜中含有挥发性的芥子油成分，该成分具有一定的刺激性，可能与抑菌作用有关，其具体的作用机制还有待进一步研究[14]。由于本研究在培养基灭菌过程中，会使得部分大蒜素和芥子油分解或挥发，从而削弱了二者的抑菌杀菌作用。若采用组织培养的方法获得大蒜和芥菜的无菌苗，无菌操作研磨并提取大蒜素和芥子油加入到供试培养基当中，则二者对该病原菌的抑制作用可能更强。同时，二者在大面积保护地或露地栽培中是否也有良好的抑菌作用，还有待进一步研究验证。

不同品种的辣椒叶片花青素的含量各不相同，7036、9007－1、1127、1121P－3等4个品种为紫色辣椒，紫色辣椒的茎、叶、花、幼果等器官中因富含花青素均表现为紫色，与普通的绿色辣椒相比，紫色辣椒植株表现出许多优良特性，比如抗病、抗逆性强[15－16]等，这可能与其中包含较高含量花青素有关。但在含有紫色辣椒成分的培养基中并未表现出对病原菌的抑制作用，可能与培养基灭菌的过程中该成分高温高压分解有关。因此尚需通过组织培养获得无菌植株，在无菌操作下获取研磨液再加入高温高压灭菌后的培养基中，才能确定紫色辣椒中花青素组分是否对该病原菌具有抑制作用。

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