人表皮生长因子的原核优势表达与复性

孙卫国，杨栗坤，熊志红，杨秉芬，刘艳华，张灵霞

解放军第309医院 结核病研究所，全军结核病防治重点实验室，北京 100091

人表皮生长因子（human epidermal growth factor，hEGF）是由53 个氨基酸残基组成的单链多肽，广泛存在于人体各种组织内。人体内EGF含量不足易导致一系列的病理变化，如胃肠道溃疡病，而补充外源性EGF 能大大缩短慢性胃溃疡的疗程[1]。EGF表达过量增加鸟氨酸脱羧酶的活性及多胺水平，也与多种肿瘤的发生、发展有关[2]。hEGF能促进烧伤、创伤及外科伤口的愈合，在烧伤、创伤、皮肤和角膜移植、外伤性皮肤溃疡等治疗中有重要作用。EGF也是某些化妆品的添加剂，具有较大的市场价值。目前利用原核系统表达重组hEGF（rhEGF）的主要弊端是表达量较低，生物活性不高，很难规模化生产。我们根据原核表达系统特点，优化影响rhEGF表达量的诸多因素，对基因核酸序列的mRNA 结构、密码子偏爱性，表达宿主菌的生长状态进行综合考虑，通过同义密码子置换合成hEGF 全基因序列，构建原核表达载体pET-24b-hEGF，获得hEGF 在原核系统内的高表达，其表达量占菌体总蛋白的15%左右。经过复性条件的优化，包涵体的复性率达90%以上，为原核系统规模化生产rhEGF打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/c3T3 细胞，大肠杆菌BL21（DE3）和载体pET24b 由本室保存；EGF 标准品由中国药品生物制品检定所提供；优化后的hEGF编码序列和测序由北京华大基因生物工程公司合成；酵母提取物、胰蛋白胨购自Oxoid 公司；hEGF 抗体购自ABcam 公司；酶标羊抗兔IgG（HRP 标记）购自中杉生物工程技术公司；MTT 购自Sigma 公司；亲和色谱填料购自GE 公司；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2 hEGF全基因序列优化与合成

根据生物软件对hEGF可能表达量的预测，对其编码序列按同义密码子进行全合成，使mRNA 的二级结构自由能满足最优表达需要，同时3′端加入大肠杆菌偏好终止密码子TAA。合成的全序列为：AACAGCGACTCTGAATGCCCGCTGTCCCACGATGGTTACTGCCT GCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATG CATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGTGAGCGTTGCCAGTAC CGTGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC。

1.3 hEGF基因克隆与表达

对合成的含有hEGF 全序列载体pUC-hEGF 以限制性内切酶NdeⅠ/XhoⅠ于37℃酶切10 h，琼脂糖胶回收酶切后小片段，与经同样双酶切的表达载体pET-24b 在T4DNA 连接酶的作用下于16℃连接4 h，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）后，挑选阳性克隆测序，取测序结果同预期结果完全一致的菌落保存。将携带有hEGF 序列的原核表达载体命名为pET-24b-hEGF。

将阳性菌落接种含卡那霉素的LB 培养基，37℃振摇过夜活化后，按1∶100 的比例重新接种LB 培养基，检测细菌的生长密度，当菌液D600nm达0.4 时，加入IPTG 使其终浓度为0.3 mmol/L，37℃诱导表达7 h，离心收集沉淀菌体，加入PBS缓冲液混匀，冰浴超声波破碎，表达菌液加入5×上样缓冲液，煮沸后取20 μL 进行20% SDS-PAGE，分析目的蛋白在原核系统内的表达量和表达形式。

1.4 rhEGF包涵体的复性与纯化

电泳鉴定rhEGF 在原核系统中以包涵体的形式生成，对包涵体进行初步纯化。收集rhEGF 沉淀包涵体，用1%的Triton X-100 洗涤3 次，4℃、5000 r/min 离心10 min；室温条件下取rhEGF 包涵体，以含8 mol/L 尿素的Tris 缓冲液（50 mmol/L，pH8.8）溶解，高速离心后取溶液上清过Q Sepharose Fastflow阴离子交换柱，并用含8 mol/L 尿素的Tris 缓冲液（50 mmol/L，pH8.8）+NaCl 进行梯度洗脱，分别收集穿过峰和各洗脱峰蛋白；采用透析复性的方法对rhEGF 包涵体进行复性，将纯化的包涵体尿素溶液以含5 mmol/L EDTA、0.1 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG 的Tris 缓冲液（50 mmol/L，pH8.8）在4℃条件下以1∶20 的体积进行透析，12 h 更换透析液一次，透析5 次后以50 mmol/L Tris 缓冲液（pH8.8）透析，整个透析过程均没有沉淀产生；取透析后复性的rhEGF进行SDS-PAGE分析。

1.5 rhEGF的Western印迹与活性检测

取纯化的rhEGF 行20%的SDS-PAGE，电转移后将硝酸纤维素膜（NC 膜）置于含5%脱脂奶粉的PBS 缓冲液中，室温封闭1 h，用TBST 漂洗3 次；将NC 膜与兔抗hEGF 抗体（1∶3000 稀释）于4℃孵育过夜，用TBST 洗涤3 次，再与适当稀释的酶标记的羊抗兔二抗于37℃反应1 h，用TBST 洗涤4 次；ECL 暗室中自动曝光显影，验证重组蛋白的抗原性。

BALB/c3T3 细胞用RPM1640 培养基培养，将对数生长期的细胞按7×103/孔加入96 孔细胞培养板，24 h 后更换成含0.5%胎牛血清的1640 培养基继续培养24 h，依次加入用维持培养液稀释的不同浓度的EGF，每浓度梯度做3 个平行孔，37℃、5% CO2培养48～72 h，MTT 法检测各孔的D490nm值，绘制D490nm-EGF浓度关系图[3]。

2 结果

2.1 hEGF原核表达载体构建

对含有hEGF 全序列的载体pUC-hEGF 进行扩增后用NdeⅠ/XhoⅠ双酶切，回收酶切后的小片段，通过连接酶克隆到表达载体pET-24b 中，筛选阳性克隆，提取质粒pET-24b-hEGF，经NdeⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，10 g/L 琼脂糖电泳结果显示，酶切后生成的条带位于目标大小160 bp处（图1）。

2.2 rhEGF的原核表达

取测序正确的含有质粒pET-24b-hEGF 的重组大肠杆菌BL21（DE3）接种含卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养，在菌液D600nm值约为0.4 时加入IPTG诱导表达7 h，离心收集沉淀，超声波破碎，20%SDS-PAGE 分析目的蛋白的表达量和表达形式。结果如图2，在相对分子质量6×103处，诱导后有rhEGF明显表达，其表达量占总蛋白的15%以上，且基本以包涵体的形式存在于超声波后的沉淀中。

2.3 rhEGF包涵体的复性与纯化

图1 pET-24b-hEGF双酶切产物的琼脂糖电泳

对表达的rhEGF 包涵体用Triton X-100 洗涤，除去脂类和降解的核酸，然后分别用2、4、6、8 mol/L的尿素溶解。SDS-PAGE 检测发现，在6 mol/L 的尿素溶液里rhEGF 包涵体得到部分溶解，而在8 mol/L的尿素溶液里全部溶解。取变性后的上清液过Q Sepharose Fastflow 阴离子交换柱，用含8 mol/L 尿素的Tris缓冲液（50 mmol/L，pH8.8）+NaCl进行梯度洗脱。当盐浓度为0.4 mol/L 时洗脱目的蛋白，一步纯化的纯度达90%以上。对洗脱上清透析复性，整个透析过程均没有沉淀产生，复性率达90%以上。取复性的rhEGF 经SDS-PAGE 分析纯度，结果如图3，纯化复性后rhEGF的Image软件扫描纯度可达93%。

2.4 rhEGF的Western印迹与活性分析

取纯化的rhEGF，经SDS-PAGE 后电转至硝酸纤维素膜上，分别和相应的一抗和二抗孵育、洗涤。与ECL 结合1 min，暗室曝光显影，结果如图4，纯化的rhEGF能与其抗体结合，具有强的抗原性。

用BALB/c3T3 细胞通过MTT 增殖法测定rhEGF的活性，以生物制品检定所提供的EGF为阳性对照，阴性对照为培养液，细胞接种数为7×103/孔。结果如图5，rhEGF 活性约为2.5×106U/mL。20～160 ng/mL 的rhEGF 对成纤维细胞具有明显的促增殖作用，与标准品表现一致，两者在统计学分析上无差异。

3 讨论

图2 hEGF原核表达形式的SDS-PAGE分析

图3 rhEGF纯化后的SDS-PAGE分析

图4 rhEGF的Western印迹

图5 rhEGF对BALB/c3T3细胞的促增殖作用

诸多因素影响外源基因在原核系统中的表达效率，如外源基因结构、密码子偏性、mRNA 翻译起始区结构，目的蛋白的毒性、氨基酸组成，表达条件的优化等[4]。成熟hEGF 具有广泛的生理功能，如加速受伤表皮细胞的修复和治疗胃肠道溃疡等[5]。目前用原核表达系统生产rhEGF 的表达量非常低。Ferrer-Soler等利用pET-22b载体获得了单体rhEGF，但表达量很低[6]。为了获得EGF 单体的高表达量，可对其氨基酸密码子进行同义置换，改变其mRNA 序列自由能，使其适合原核表达系统的特点。我们采用生物信息学方法，参照生物软件Vector NTI Suitor 7.0 对hEGF 核酸序列进行分析和合成，实现其在原核系统内的优势表达，表达量约占菌体总蛋白的15%；同时，对rhEGF 包涵体的复性进行了摸索研究，使包涵体的复性率达到90%以上。本实验为进一步研究hEGF的结构和功能奠定了基础，也可为获得重组蛋白在原核系统的高表达提供借鉴和参考。

[1]路莉,吴勇杰,高明堂,等.重组人表皮生长生长因子胶囊对大鼠慢性胃溃疡愈合质量的影响[J].中国药理学通报,2004,20(1):75-78.

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[3]郑敏,严莉,黄清松.EGF 在比赤酵母中的表达及活性测定[J].解剖学研究,2013,35(1):36-38.

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