胡桃醌对宫颈癌SiHa细胞增殖及细胞周期的影响

张 巍，吴亚猛，陈思瑶，张琳娜，韩景春，那文婷，金 瑛

（1.吉林医药学院生物化学教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院临床医学院，吉林 吉林 132013；3.吉林医药学院药学院药物化学教研室，吉林 吉林 132013）

宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤，近年来其发病呈年轻化的趋势，引起广大年轻女性的重视，因此对于抗宫颈癌药物的研发极为迫切［1］。胡桃醌（Juglone）是从胡桃楸新鲜根、枝皮及青果皮等中提取出来的羟基奈醌类化合物，黄色针状结晶，熔点为155℃，有升华性，微溶于热水，是核桃楸中毒性物质之一，具有抗肿瘤的活性［2－3］。胡桃醌在体外对肝癌和黑色素瘤等多种肿瘤细胞株具有细胞毒作用，可诱导其凋亡［4－6］。国内外有很多关于胡桃醌抗肿瘤的报道，本课题组在前期研究［7－9］中发现：胡桃醌具有可抑制宫颈癌HeLa细胞 （含HPV18DNA）的增殖及诱导其发生凋亡的作用。本研究旨在研究胡桃醌对另外一种宫颈鳞癌SiHa细胞 （含HPV16DNA）细胞周期的影响，从而为胡桃醌的抗宫颈癌作用提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 SiHa细胞由本学院科学实验室保存。塞唑蓝 （MTT）、胡桃醌 （5－羟基－1，4－奈醌）和二甲基亚砜 （DMSO）购于美国Sigma公司。流式细胞仪购于美国Becton－Dickson公司，倒置显微镜购于德国Leica公司。

1.2 细胞培养 SiHa细胞用含10%新生小牛血清的DMEM完全培养液培养于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中，湿度95%。细胞单层贴壁生长，每2d更换1次培养基，细胞每周按1∶3传代。

1.3 MTT法检测细胞增殖活性和生长抑制率取对数生长期的SiHa细胞，调细胞悬液密度为1×105mL－1，按每孔100μL接种于96孔培养板。分为对照组和不同浓度胡桃醌处理组 （用胡桃醌与完全培养液配制成 10、20、40、60、80 和100μmol·L－1不同的浓度培养），复孔数为3。待细胞贴壁后弃去培养液，给药后培养24h，每孔加入20μL MTT，37℃孵育4h，弃去上清后每孔加150μL DMSO，在摇床上低速振荡10min，酶标仪490nm波长测吸光度 （A）值并记录结果，以A值代表细胞增殖活性，计算细胞生长抑制率，半数抑制浓度 （IC50）通过SPSS统计学软件获得。同时在倒置显微镜下观察对照组及10和100μmol·L－1胡桃醌处理组细胞生长状态并拍照。

1.4 流式细胞术检测细胞周期的变化 给药12h后，收集10和100μmol·L－1胡桃醌处理组细胞，同时以未处理细胞作为对照组，每组1×106个细胞，用70%冰乙醇4℃固定过夜，1000r·min－1离心5min，用PBS漂洗2次，之后每组加入PI染液400μL，4h避光孵育30min后过滤，最后上机，WinMDI软件分析结果。

1.5 统计学分析 采用SPSS 10.0软件进行统计学处理。细胞增殖活性、细胞生长抑制率以表示，F检验方差齐性后，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组SiHa细胞增殖活性和生长抑制率 不同浓度胡桃醌处理SiHa细胞24h后，采用MTT法检测得各组细胞A值，计算胡桃醌对宫颈癌SiHa细胞生长的抑制率，结果见表1。与对照组比较，不同浓度胡桃醌处理组细胞增殖活性降低，细胞生长抑制率升高，且呈浓度依赖性，与对照组比较差异有统计学意义 （P＜0.05或P＜0.01）。通过标准曲线软件可计算出胡桃醌对SiHa细胞的IC50为20.7μmol·L－1。

表1 各组SiHa细胞增殖活性和生长抑制率Tab.1 Proliferation activities and inhibitory rates of growth of SiHa cells in various groups （n＝3，）

表1 各组SiHa细胞增殖活性和生长抑制率Tab.1 Proliferation activities and inhibitory rates of growth of SiHa cells in various groups （n＝3，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with control group.

Group Cell proliferation activity（A value）Inhibitory rate of growth（η／%）Control 0.85±0.110 Juglone（μmol·L－1）10 0.72±0.12＊ 16.4±3.3＊20 0.43±0.06＊ 50.5±5.2＊40 0.32±0.08＊ 63.2±6.6＊60 0.28±0.03＊＊ 68.2±8.2＊＊80 0.20±0.04＊＊ 77.3±10.6＊＊100 0.15±0.06＊＊ 84.2±11.5＊＊

2.2 倒置显微镜下观察各组细胞形态学 对照组细胞生长状态良好，胡桃醌处理组细胞体积缩小，连接消失，与周围细胞脱离，生长状态差并呈剂量依赖性 （图1）。

2.3 各组SiHa细胞流式细胞术检测结果 12h后与对照组比较，10和100μmol·L－1胡桃醌处理组SiHa细胞的亚二倍体峰 （SubG1）比率增加，而G0／G1和S期细胞比率均降低，G2／M期细胞比率先升高后降低。见图2。

图1 各组SiHa细胞形态学（×400）Fig.1 Morphology of SiHa cells in various groups（×400）

图2 各组SiHa细胞流式细胞术检测结果Fig.2 Detection results of flow cytometry of SiHa cells in various groups

3 讨 论

Pin1是癌细胞中普遍存在的高表达基因之一，与肿瘤细胞中的细胞分化和增殖有关，其在肿瘤细胞中过表达，而在正常组织中低表达，去除Pin1则肿瘤细胞增殖减低，凋亡增加［10－11］。胡桃醌又名5－羟基－1，4－萘醌，是一种天然环状醌类化合物，可从胡桃楸的叶及外壳中提取，是Pin1的天然抑制剂，其抗肿瘤作用在国内外均有报道。胡桃醌的抗肿瘤活性主要是其能与Pin1催化域发生不可逆结合，从而抑制 Pin1 的活性［12－13］。

在本实验中，本文作者首先选用形态学及MTT法对胡桃醌的细胞毒性作用进行初步的检测，结果显示：胡桃醌可抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖，形态学检测可见对照组细胞生长状态良好，细胞形态规则，而胡桃醌处理组细胞生长受到抑制，生长状态差，可见细胞皱缩，其变化的严重程度随胡桃醌的剂量增加而增加，具有剂量依赖性。本研究中胡桃醌的IC50值为20.7μmol·L－1，说明胡桃醌对宫颈癌SiHa细胞具有毒性作用。

细胞周期是指连续分裂的细胞，从一次完成分裂开始，到下一次完成分裂时为止的过程。一般分为2个阶段：分裂间期和分裂期［14－15］。目前检测细胞周期的方法有流式细胞术和激光共聚焦等。本实验采用流式细胞术检测胡桃醌对细胞周期的影响，结果显示：不同浓度胡桃醌可导致亚二倍体SubG1比率增加，而 G0／G1、S期细胞比率降低，但G2／M期的细胞比率先升高后降低。说明胡桃醌可导致SiHa细胞的周期发生改变，而仅有低剂量可诱发G2／M期阻滞。

综上所述，胡桃醌具有抑制宫颈癌SiHa细胞体外增殖的作用，并可诱导其细胞周期发生改变［16－18］，但其在诱导宫颈癌细胞周期改变的过程中，细胞周期相关基因的变化及凋亡信号的产生还有待深入研究，以进一步阐述胡桃醌抗肿瘤的作用机制。

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