复方芩柏颗粒剂对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜AQP4、AQP8表达的影响

贺荔枝，尹 明，王真权*

（1.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙410005；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）是一种原因不明的慢性直肠和结肠炎性疾病，临床表现主要为腹泻、腹痛、黏液脓血便，病变主要位于结肠黏膜及黏膜下层，中医药治疗UC 有一定优势[1]。 复方芩柏颗粒剂有清热祛湿之功效，是我院临床应用近20年并已获国家知识产权局专利保护的自制药，在前期的研究中， 证实复方芩柏颗粒剂对治疗UC 大鼠具有确切的疗效[2-4]。 有研究[5]发现影响机体水液代谢的水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）与湿病关系密切， 推测AQPs 的表达失常可能是UC 的病理机制之一。 正所谓“无湿不成泄”，本实验选取有清热利湿之功效的复方芩柏颗粒剂干预治疗UC 模型大鼠， 通过免疫组化法检测UC 大鼠结肠黏膜AQP4、AQP8 的表达水平， 初步探讨复方芩柏颗粒剂治疗大鼠的部分作用机制及AQPs 的表达与UC 的相关性， 探寻中医祛湿理论与水液代谢理论的关联性，为中医药治疗UC 提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与仪器

SPF 级SD 大鼠80 只， 雄性， 体 质量180～200 g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(湘)2011-0003；JY3002 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；Leica DM LB2 型双目显微镜（德国Leica 公司）；MIAS 医学图像分析系统（北航公司）；Shandon325 型石蜡切片机（英国Shandon 公司）；Motic B5 显微摄像系统 （麦克奥迪实业集团公司）等。

1.2 药物及试剂

将中成药复方芩柏颗粒剂（由黄芩、黄柏、制大黄、秦艽、防风、泽泻、当归、桃仁、生地黄、槟榔、延胡索11 味中药组成，由湖南省中医院药剂科制备，规格：6 g/包，产品批号：20130924）6 g 溶于100 mL蒸馏水中制成6%芩柏颗粒剂溶液（60 mg/mL）。 因成人灌肠用药剂量为6 g/d， 按成人体质量70 kg、实验大鼠体质量为180～200 g 参照常用实验大鼠与人的体表面积比值（R）表计算，每只大鼠每日给药剂量为108 mg （即大鼠给药量为0.54 g/kg），奥沙拉秦钠胶囊 （天津力生制药股份有限公司生产，产品批号：1311004）， 参照常用实验动物与人的体表面积比值（R）表计算，每只大鼠每日给药剂量为36 mg(即大鼠给药量为0.18 g/kg)。

其他试剂：5%三硝基苯磺酸 (TNBS，Sigma 生产)；无水乙醇、4%多聚甲醛溶液、二甲苯、苏木素染液、伊红水液、中性树胶（由湖南中医药大学医学基础实验室中心提供）；AQP4 多克隆抗体 （武汉博士德生物工程有限公司， 批号：1401132）、AQP8 多克隆抗体 （武汉博士德生物工程有限公司， 批号：1401081）、SABC 免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：1312061）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 将大鼠随机编号，常规饲养1 周后随机选取20 只大鼠作为正常组， 余下大鼠进行造模，造模成功后，再随机将60 只UC 模型大鼠分为3 组： 模型组、奥沙拉秦钠组（简称西药组）和复方芩柏颗粒剂组(简称中药组)，每组20 只。

1.3.2 动物造模及给药方法 参照Morris 等[6]及陈英群等[7]方法建立与人类UC 结肠黏膜病理组化相近的UC 大鼠模型。 实验前，大鼠禁食不禁水24 h，用棉签刺激大鼠肛门排出大便。 实验时，先用10%的水合氯醛(3 mL／kg 剂量)使大鼠轻微麻醉，而后将一直径2 mm、 长约12 cm 的硅胶输液管用石蜡油充分润滑后轻缓插入大鼠肠腔内，进入深度大约8 cm，继而把TNBS(100 mg／kg)和50%乙醇溶液(1∶1，v／v)0.25 mL 溶液一次性由硅胶管内注入，提起大鼠尾部，将其持续倒置约5 min。 造模后，使动物保持平躺，自然清醒，自由饮食。 在同一操作条件下，正常组大鼠肠腔内注入等体积生理盐水。造模第1、2 天，大鼠相继出现精神倦怠，懒于活动，拱背扎堆，饮食减少，粪便性状改变（大便稀溏、末端大便有黏液或脓点）等表现。 造模后第3 天，随机抽取两只大鼠处死，迅速剖腹，分离结肠，沿肠系膜缘剪开肠腔，冰生理盐水冲洗，距肛门约8 cm 处可见明显糜烂及溃疡面，组织学检查确认有充血、水肿、炎性细胞浸润、 腺体破坏及典型的溃疡形成等病理学改变，证实造模成功。

造模成功后第3 天， 各组大鼠开始灌肠给药：西药组以奥沙拉秦钠溶液1.8 mL 灌肠； 中药组以6%复方芩柏颗粒剂溶液1.8 mL 灌肠； 模型组和正常组开始以等体积生理盐水1.8 mL 灌肠， 每天1次，连续灌肠治疗3 周。

1.4 标本取材及检测指标

治疗结束（3 周）后处死大鼠，迅速将其剖腹，剪取肉眼观察病变最明显的结肠标本， 用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片。 采用免疫组化法检测各组大鼠结肠组织中AQP4、AQP8 的表达。 记录平均每1 000个细胞中的阳性细胞数、平均光密度（每张切片选3～5个不重叠视野， 测定每个视野的平均光密度， 其中细胞质或细胞膜中颜色为浅黄色至棕黄色或褐色者表示为阳性）， 对AQP4、AQP8 蛋白进行半定量分析，在400 倍光镜下进行观察，采用显微镜成像系统，用MIAS 医学图象分析系统分析。 以阳性细胞染色的个数及平均光密度值表示抗原的表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠结肠黏膜AQP4、AQP8 的表达

AQP4 在正常组、模型组、西药组及中药组的免疫阳性表达物为棕黄色颗粒，主要表达在结肠的黏膜顶部的吸收细胞，在其基底部及腔面可见棕黄色阳性反应颗粒，胞质内则可见极少数。 模型组大鼠结肠黏膜中AQP4 的阳性表达细胞明显减少； 西药组及中药组大鼠结肠黏膜中AQP4 的阳性表达细胞明显增多。 见封三彩图图1。

AQP8 主要表达在结肠上皮细胞的顶膜和基侧膜，以及基底腺体胞浆也可见棕黄色免疫阳性反应颗粒。模型组大鼠结肠黏膜中AQP8 阳性表达细胞明显减少； 西药组及中药组大鼠大肠黏膜中AQP8阳性表达细胞明显增多。 见封三彩图图2。

2.2 各组大鼠结肠黏膜AQP4、AQP8 的阳性细胞数及平均光密度值比较

与正常组比较， 模型组结肠组织AQP4、AQP8阳性细胞数及平均光密度值明显低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，西药组、中药组结肠组织AQP4、AQP8 阳性细胞数及平均光密度均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠结肠组织AQP4、AQP8 蛋白表达的比较（±s，n=20）

表1 各组大鼠结肠组织AQP4、AQP8 蛋白表达的比较（±s，n=20）

注：与正常组比较**P＜0.01；与模型组比较▲▲P＜0.01。

组 别正常组模型组西药组中药组阳性细胞数146.59±10.10 64.50±7.41**129.42±7.74▲▲124.42±8.97▲▲平均光密度0.55±0.14 0.35±0.09**0.44±0.07▲▲0.48±0.07▲▲阳性细胞数245.50±17.93 74.90±7.91**140.58±18.35▲▲148.25±7.45▲▲平均光密度0.56±0.10 0.38±0.10**0.46±0.09▲▲0.47±0.08▲▲AQP4 AQP8

3 讨论

水通道蛋白[8]是细胞膜上与水通透密切相关、对水专一的具有高度选择性的糖蛋白，广泛分布于人体的肺、胃、肠、肾、脑等器官，参与水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡，在机体水平衡和内稳态的维持中发挥重要作用。 祖国医学认为肺、脾、肾、大肠、小肠等脏腑在人体的水液代谢中发挥着重要作用，提示AQPs 与中医理论的肺、脾、肾、大肠、小肠等脏腑功能密切相关。 近年来已有文献证实结肠组织AQPs 的分布与肠道水液代谢异常性疾病有密不可分的关系： 如便秘患者结肠黏膜AQP4 出现高表达[9]，在便秘模型小鼠结肠组织中发现AQP4、AQP8的表达水平也较正常组偏高[10]，说明AQPs 的高表达加速了肠道水分的吸收， 成为便秘的病因之一；湿热型泄泻肠易激综合征模型大鼠结肠组织的AQP4 出现低表达[11]、脾虚肝旺型肠易激综合征模型大鼠(腹泻型)的结肠组织出现AQP8 低表达[12]；脾阳虚型腹泻模型大鼠结肠组织出现AQP4 低表达[13]、五苓散可通过上调腹泻模型大鼠结肠AQP4的表达而达到止泻目的[14]，均证明因AQPs 的低表达降低了肠道对水分的吸收而导致腹泻。 涉及UC的报道较少，已有研究[15]证实脾虚湿困型UC 大鼠的结肠组织中AQP4 出现低表达， 参苓白术散能增强脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织中AQP4 的表达，促进机体水液代谢功能的恢复。 UC 以腹泻、腹痛、黏液脓血便为主症， 腹泻状态下大鼠结肠AQPs 表达下调，结肠对肠腔内水分的吸收减少，大便稀薄，含水量增加形成腹泻。 由此可见，AQPs 表达量的变化可能参与了肠道水代谢紊乱性疾病的病理生理过程，与湿阻中焦、脾胃湿热、脾虚湿困等湿性病证有密不可分的联系。

在前期的研究[2-4]中，通过对UC 大鼠结肠组织的形态学评分、 病理切片的组织学评分以及IL-2、NF-κB p65 的表达进行分析，证实复方芩柏颗粒剂能减轻结肠组织的炎症损伤， 能有效改善UC 大鼠的排便情况。 实验结束后，模型组部分大鼠大便为稀便，部分有不同程度脓血便，体质量较实验前下降；西药组部分大鼠粪便性状恢复正常，部分大鼠仍表现为稀便， 大鼠体质量较实验前有所增加；中药组大鼠大便呈颗粒状或软便，大鼠体质量较实验前有一定增加。 本实验采用TNBS 法结合乙醇复合物灌肠法制备UC 模型大鼠，通过免疫组化法对UC大鼠结肠组织中AQP4、AQP8 的表达进行检测，结果显示模型组大鼠结肠黏膜AQP4、AQP8 均出现低表达，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01)，提示AQPs 表达的减少导致结肠黏膜对水的重吸收不足进而引起腹泻； 中药组大鼠结肠黏膜AQP4、AQP8 阳性表达细胞较模型组显著升高， 其差异有统计学意义（P＜0.01)，提示复方芩柏颗粒剂可能通过上调UC 大鼠结肠AQP4、AQP8 的表达， 促进结肠组织水液代谢功能的恢复， 减少结肠内水含量，缓解腹泻症状，从而达到治疗作用。 本实验选取具清热祛湿之功的复方芩柏颗粒剂治疗UC 大鼠，方中黄芩、黄柏为君药，有清热燥湿，泻火解毒之功；防风、秦艽祛风胜湿，泽泻利水渗湿共为臣药；生地黄清热凉血，当归补血活血，延胡索行气止痛，合为佐药；桃仁活血化瘀，大黄泻火解毒与槟榔行气利水共为使药。 此方能改善机体运化水湿的功能，缓解UC 大鼠腹泻症状， 反证其通过上调UC 大鼠结肠组织中AQPs 的表达而达到治疗作用。 研究亦提示了AQPs 在UC 发病中的作用， 其对结肠水液代谢的影响是UC 发病的作用机制之一。

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