四种杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力比较

黄保宏，高正良，周本国，陈方旭，许大凤，王芳

1 安徽科技学院 安徽 凤阳 2331001；

2 安徽省农科院烟草研究所 合肥 230031

植物保护

四种杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力比较

黄保宏1，高正良2，周本国2，陈方旭1，许大凤2，王芳2

1 安徽科技学院 安徽 凤阳 2331001；

2 安徽省农科院烟草研究所 合肥 230031

为筛选对烟草青枯病菌更具抑菌作用的杀菌剂，采用“改良抑菌圈法”测定了4种杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力。结果表明：4种杀菌剂抑菌率随浓度提高，青枯灵、农用硫酸链霉素和克菌康在1450.0、310.0和700.0mg·L-1浓度下，72 h时抑菌率分别达到94.3%、89.1%和84.4%，辛菌胺醋酸盐的抑菌率在48 h时达到最高78.1%。4种药剂对烟草青枯病菌的毒力大小依次为农用硫酸链霉素＞辛菌胺醋酸盐＞青枯灵＞克菌康，前两者EC50分别为274.57mg·L-1和148.25mg·L-1。表明辛菌胺醋酸盐和农用硫酸链霉素是防控烟草青枯病较为理想的杀菌剂。

改良抑菌圈法; 杀菌剂; 烟草青枯病菌; 毒力测定

烟草青枯病是一种由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的系统性侵染细菌病害，是烟草生产毁灭性病害之一，主要危害烟株维管组织，往往造成整株死亡[1]。尤以长江流域及其以南烟区烟草青枯病普遍发生，且有向北扩展的趋势，对优质烟叶生产构成巨大威胁。目前，生产上由于常年大面积施用单一农药防治该病，易造成病菌抗药性增强，使防效不佳。再加上，烟农滥施氮肥、连作以及减少有机肥使用等加剧了青枯病的发生，使其防治更加困难。虽然在抗病品种[2-4]、轮作[5]、拮抗菌[6]和化防[1,7-8]等措施获得一定防效，但当前烟叶生产上对该病防治仍以化防为主，且对青枯病无特效药剂或没有理想的防治措施。因此，对杀菌剂进行毒力测定是筛选有效防治药剂的一项重要内容。国内外有关杀菌剂室内毒力测定报道很多[9-11]，但关于克菌康、青枯灵、辛菌胺醋酸盐和农用硫酸链霉素等杀菌剂对烟草青枯病菌的抑菌作用未见报道，本研究采用“改良抑菌圈法”对这四种杀菌剂进行了毒力测定，以期筛选出对烟草青枯病菌具有较高毒力的杀菌剂，为该病科学化学防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和培养基

烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum），从安徽宣州黄渡乡西扎典型青枯病症状烟株分离的供试菌株。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L-1、酵母提取物5g/L-1、氯化钠10g/L-1、琼脂18g、蒸馏水1L。

1.2 供试药剂和仪器设备

72%农用硫酸链霉素SP，华北制药股份有限公司；1.8%辛菌胺醋酸盐AS，江苏东宝农药化工有限公司；3%克菌康WP，厦门凯立生物制品有限公司；35%青枯灵WP，丹东市农药总厂。

YΧQ-LS-SⅡ立式全自动电热压力蒸汽灭菌器（上海天呈实验仪器制造有限公司）、RΧZ 106L-A智能人工气候箱（宁波东南仪器有限公司）、SWOJ-2F洁净工作台（苏州安泰）等。

1.3 试验方法

1.3.1 药剂浓度设置

农用硫酸链霉素浓度设为260.0、270.0、280.0、290.0、300.0 和 310.0mg·L-1；辛菌胺醋酸盐浓度设 为 1200.0、1300.0、1400.0、1500.0、1600.0 和1700.0mg·L-1；克 菌康 设为 450.0、500.0、550.0、600.0、650.0 和 700.0mg·L-1； 青 枯 灵设 为 850.0、950.0、1050.0、1250.0、1350.0 和 1450.0mg·L-1。

1.3.2 杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力测定

对经典抑菌圈法进行改良，并测定4种杀菌剂毒力。具体做法：打取Φ 6 mm中性滤纸片经高压蒸汽灭菌晾干后投入1.3.1配制的杀菌剂药液中吸附10 s，取出滤纸片沥干多余的药液，将已吸附药液的4张滤纸片放置于距培养皿中心点2 cm处呈“十”字状排列，然后用接菌环挑取培养24 h的烟草青枯病菌落的边缘部分，点接于培养皿中心处。并将已接菌的培养皿倒置放在（30±1）℃人工气候箱中培养72 h，每隔24 h用全自动菌落分析仪测量1次菌落直径，并记录和计算菌落生长情况及其抑菌率。

本试验采用每种杀菌剂6个浓度梯度处理，3皿/每处理，重复3次，以无菌水代替农药浸滤纸片作为空白对照（CK）。

1.4 数据分析

采用EΧCEL 2007和DPS V7.05数据处理系统软件求出各杀菌剂对烟草青枯病菌的抑菌率、毒力回归方程y= a + bx、EC50、95%置信限和R2。抑菌率公式如下：

2 结果与分析

2.1 杀菌剂对烟草青枯病菌的抑菌效果

由表1可知，随着杀菌剂浓度增加，其对烟草青枯病菌的抑制率逐渐上升，但在不同浓度下，4种杀菌剂持续抑制效果表现各异。当农用硫酸链霉素浓度260.0mg·L-1时对青枯病菌抑制率随着时间增加而呈现先扬后抑；当 270mg·L-1～310mg·L-1时，抑制率逐渐上升，表现为高浓度时对菌株的持续抑制效果较好，而低浓度时则下降，310mg·L-1时，72 h抑制率达到89.1%。辛菌胺醋酸盐浓度1200mg·L-1时随着时间增加其抑制率逐渐降低，当 1300mg·L-1～1700mg·L-1时抑菌率也表现为先扬后抑，48 h时辛菌胺醋酸盐抑制率最高，其中当1700.0mg·L-1时抑制率达到78.1%，这说明高浓度时对病菌的持续抑制效果较低浓度时好。克菌康在 450.0mg·L-1～700.0mg·L-1下，抑制率随着时间的延长逐渐升高，当700mg·L-1时抑制率达到 84.4%。青枯灵浓度 850.0mg·L-1～1250.0mg·L-1时，该药抑制率在24 h时达到最大，随着时间延长抑菌率逐渐降低，当 1350mg·L-1和 1450mg·L-1时，抑制率逐渐升高，当1450mg·L-1，72 h时抑制率达到94.3%。

同时，由表1还可看出，农用硫酸链霉素在较低浓度（260.0mg·L-1～310.0mg·L-1）下对烟草青枯病菌抑菌率在四种杀菌剂中抑菌效果较好且持效期较长，而辛菌胺醋酸盐低浓度时抑菌率下降且持效期较短。克菌康较高浓度（450.0mg·L-1～700.0mg·L-1）下抑菌率较低且持效期较长。青枯灵较低浓度下（850.0mg·L-1～1250.0mg·L-1）抑菌率较低且持效期较短；高浓度（1350.0mg·L-1～1450.0mg·L-1）、72 h 时，抑菌率是四种杀菌剂中最高的。

表1 各杀菌剂对烟草青枯病菌的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effect of 4 fungicides on Ralstonia solanacearum

续表1

2.2 各杀菌剂对烟草青枯病菌的EC50和敏感性比较

EC50是衡量杀菌剂毒力大小的重要指标之一，EC50越小表明该药剂对病原菌的毒力越强。由表2可知，四种杀菌剂毒力大小依次为农用硫酸链霉素＞辛菌胺醋酸盐＞青枯灵＞克菌康。

毒力回归方程斜率是病原菌对杀菌剂剂量变化的反应速率。农用硫酸链霉素和辛菌胺醋酸盐的毒力方程的斜率分别为1.12和1.35，而克菌康和青枯灵则分别为2.53和2.61，说明在特定药剂浓度范围之内，烟草青枯病菌对克菌康和青枯灵的敏感性高。只有将杀菌剂对病菌的EC50和毒力回归方程的斜率这二者相结合才能较为科学地评价杀菌剂室内毒力测定的结果。综上所述，四种杀菌剂要达到相同的抑菌作用，所需药剂浓度差异较大，四种杀菌剂所需浓度大小顺序依次为青枯灵＞克菌康＞辛菌胺醋酸盐＞农用硫酸链霉素。烟草青枯病菌对青枯灵和克菌康的敏感性均高于农用硫酸链霉素和辛菌胺醋酸盐，然而，克菌康和青枯灵对烟草青枯病菌的EC50却远大于农用硫酸链霉素和辛菌胺醋酸盐。因此，室内毒力测定结果表明农用硫酸链霉素和辛菌胺醋酸盐是防控烟草青枯病菌较为理想的药剂之一。

表2 各杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力Tab.2 Toxicity of 4 fungicides to Ralstonia solanacearum

3 结论与讨论

四种杀菌剂均表现出对烟草青枯病菌生长具有不同程度的抑制作用，且呈现随浓度增加，抑菌率也逐渐提高的趋势，对烟草青枯病菌毒力大小依次为农用硫酸链霉素＞辛菌胺醋酸盐＞青枯灵＞克菌康。测定结果表明农用硫酸链霉素和辛菌胺醋酸盐均为烟草青枯病菌防控作用效果较为理想的药剂，这与贾春燕、李良孔等[7，12]田间防治药剂筛选结果一致，但与陈志敏等田间防治药剂筛选结果有一定的差异[8]。其产生的原因可能是：第一，不同地区田间化防频度和水平不一致造成的。有的地区长期、高水平化防用药，致使病原菌敏感性降低，抗药性增强，有的地区化防用药频度和水平低，病原菌敏感性则高；第二，供试病原菌没有或几乎未与杀菌剂接触，其敏感性高于田间的病原菌；第三，室内毒力测定条件比较严格，而田间药效测定是在开放环境下进行，易受环境因素影响。具体原因有待今后进一步深入研究。

本试验采用的“改良抑菌圈法”与经典抑菌圈法比较，抑菌圈大小、清晰度与供试菌株、杀菌剂药量、杀菌剂扩散能力、扩散时间以及培养基厚薄等有一定的关系，这与经典抑菌圈法具有一致性[13]。因此，“改良抑菌圈法”可直接挑取细菌菌落点接，而不需预先配置菌液和培养基混合，具有更加方便、快捷等特点。

[1]孔凡玉，卢平，许永峰，等.20%青枯灵可湿性粉剂防治烟草青枯病药效试验初报[J].中国烟草科学，2004，25（1）：36-37.

[2]匡传富，罗宽.烟草品种对青枯病抗病性及抗性机制的研究[J]．湖南农业大学学报，2002，28（5）：395-398．

[3]高加明，王志德，张兴伟，等.香料烟青枯病抗性基因的遗传分析[J].中国烟草科学，2010，31（1）：1-4.

[4]宋浩，丁伟，沙伟，等.不同烟草青枯病抗性品种的蛋白质组学比较[J].中国烟草科学，2011，32（5）：70-76.

[5]晋艳，杨宇虹，段玉琪，等.烤烟轮作、连作对烟叶产量质量的影响[J].西南农业学报，2004，17（增刊）：267-271.

[6]张秀玉，孔凡玉，王静，等.枯草芽孢杆菌SH7抑菌蛋白的分离纯化及对烟草青枯病菌的抑制作用[J].中国烟草科学，2010，31（1）：13-15.

[7]贾春燕，郑洪波.防治烟草青枯病的药剂筛选[J].山东农业科学，2010（8）：76-78.

[8]陈志敏，彭业敏，张晓阳，等.烟草青枯病田间防治药剂的筛选[J].湖南农业科学，2012，（07）：79-81.

[9]李斌，龚国淑，周修勇，等.6种杀菌剂对烟草黑胫病菌的毒力测定[J].烟草科技,2009(1):64-66.

[10]范鸿雁，谢艺贤，张辉强.几种杀菌剂对香蕉枯萎病菌的室内毒力测定[J].农药,2004(3):48-49.

[11]张胡焕，谢艺贤，蒲金基，等.常用杀菌剂及其混剂对芒果炭疽病菌的毒力测定[J].农药,2010(01):69-70,73.

[12]李良孔，袁善奎，严清平，等.辛菌胺对15种植物病原菌的离体抗菌活性研究[J].农药科学与管理，2010，31（7）：32-34.

[13]游文莉,许文耀.杀细菌剂毒力测定方法的研究[J].农药科学与管理,2002,23( 2):21-22.

Toxicity test of four fungicides againstRalstonia solanacearum

HUANG Baohong1，GAO Zhengliang2，ZHOU Benguo2，CHEN Fangxu1，ΧU Dafeng2，WANG Fang2
1 Anhui Science and Technology University,Fengyang 233100,Anhui,China；
2 Tobacco Research Institute of Anhui Provincial Academy of Agriculture,Hefei 230031,China

Toxicity of four fungicides againstRalstonia solanacearumwas measured by improved inhibition zone method in order to fi nd which fungicide boasted the best inhibitory effect.Results indicated that inhibition rates gradually rose with the increase of concentration.Inhibition rates of Qingkuling,Agricultural streptomycin sulfate and Zhongshenguycin reached 94.3%,89.1% and 84.4% in 72 h under the concentration of 1450,310 and 700mg·L-1,respectively.The inhibition rate of Χinjunan acetate was as high as 78.1% in 48 h.The toxicity level of four fungicides was in the following order:Agricultural streptomycin sulfate＞Χinjunan acetate＞Qingkuling＞Zhongshenguycin.The toxicity of Agricultural streptomycin sulfate and Χinjunan acetate was higher than that of Qingkuling and Zhongshenguycin.The EC50 of Agricultural streptomycin sulfate and Χinjunan acetate was 274.57 ug·L-1and 148.25 ug·L-1,respectively.It was concluded that Agricultural streptomycin sulfate and Χinjunan acetate were ideal fungicides for prevention ofRalstonia solanacearum.

bacteriostatic circle; fungicides;Ralstonia solanacearum; toxicity measurement

黄保宏，高正良，周本国,等.四种杀菌剂对烟草青枯病菌的毒力比较[J].中国烟草学报，2015,21（1）

安徽省烟草有害生物调查研究项目（20100551005）

黄保宏（1966—），教授，主要从事植物保护研究，Email：bhhuang9258@sina.com

高正良（1963—），研究员，主要从事烟草植保研究，Email：gaozl63@sohu.com

2014-02-22

:HUANG Baohong，GAO Zhengliang，ZHOU Benguo,et al.Toxicity test of four fungicides againstRalstonia solanacearum[J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(1)