晒黄烟调制期叶面可培养细菌的多样性研究

夭建华，钱颖颖，陈建华，王毅，魏云林

倪红梅1,2，李雪梅1，谢丽华1，米其利1，

1 云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明北市区红锦路367号 650231;

2 昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650500

晒黄烟调制期叶面可培养细菌的多样性研究

夭建华1，钱颖颖1，陈建华1，王毅1，魏云林2

倪红梅1,2，李雪梅1，谢丽华1，米其利1，

1 云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明北市区红锦路367号 650231;

2 昆明理工大学生命科学与技术学院，昆明 650500

以云南特色晒黄烟烟叶为供试样品，对调制期三个部位烟叶定期取样，研究叶面可培养细菌的动态变化和多样性。结果表明，晒黄烟调制期叶面可培养细菌总量呈先升高后降低再略升高的趋势。细菌种群较为丰富，主要分布在Bacillus属、Pseudomonas属、Arthrobacter属和Exiguobacterium属等10个属。Bacillus属菌株是整个调制期的优势细菌类群，与烤烟烟叶的优势种群基本一致。

晒黄烟；烟叶调制；可培养细菌；动态变化；多样性

晒黄烟是我国特有的一种烟叶类型，在我国已有几百年的栽培历史[1]。与烤烟相比，晒黄烟具有独特的烟叶品质，能满足卷烟品牌对原料多样化的需求[2-6]。云南晒黄烟是我国重要的晾晒烟品种资源，属于淡色晒黄烟，经过长期的自然选择和人工栽培，形成了独特的香型和品质，除可做混合型卷烟原料外，还可兼做烤烟型卷烟原料[2]。烟叶微生物在烟叶调制和发酵过程中起着重要作用，这些微生物随调制方式和发酵条件的变化而发生变化，对烟叶产品的形成及其品质产生了不同的作用[7-15]。关于晒黄烟烟叶微生物的研究，仅见周燕等将从湖南宁乡晒黄烟植株中分离的内生菌用于烟草青枯病的防治[16]，云南晒黄烟烟叶微生物的研究尚未见报道。本文以云南晒黄烟烟叶为材料，分析了烟叶调制过程中叶面可培养细菌的动态变化，对分离到的细菌进行了序列分析、系统发育分析和优势菌群分析，为微生物在晒黄烟烟叶人工调控调制过程中提升烟叶品质的应用提供一定的理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

胰蛋白大豆琼脂培养基和胰蛋白大豆培养基（美国BD公司）；两性霉素B（Sigma公司）；磷酸缓冲液（pH7.0-7.2，HyClone公司）。

超净工作台（苏州安泰公司）；电子天平（感量0.1mg,Mettler Toledo ΧS204）；隔水式恒温培养箱（广州永程公司）；恒温水浴摇床（德国VIVO公司）；恒温培养摇床（上海一恒公司）；自动菌落计数仪（杭州迅数公司）；高压蒸汽灭菌锅（日本ALP公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 烟叶调制和取样

烟叶样品取自晒黄烟品种云晒1号，种植于云南盈江县弄璋晒黄烟基地。将新鲜烟叶采收、编杆后置于晾晒棚内进行自然晒制，晾晒棚所在地地势平坦、通风向阳、干燥，棚成屋脊形，4周盖上塑料膜。

2013年3月至4月期间，从新鲜烟叶采收到烟叶调制结束，分别收集下、中、上3个部位的烟叶，每3天取样一次，将收集的烟叶样品放置于无菌采样袋中，4℃保存备用（储存时间不超过5 d）。

1.2.2 细菌的分离和计数

烟叶菌悬液的制备参照张成省等[17]，略有改进。准确称取烟叶5g，放入盛有95mL无菌磷酸缓冲液的三角瓶内，置于恒温培养摇床中室温160rpm震荡30min后，用双层无菌纱布过滤后收集滤液，并用无菌磷酸缓冲液将滤液梯度稀释，制成菌悬液，备用。

叶面细菌的分离使用胰蛋白大豆琼脂培养基，采用稀释涂布平板法进行，每个浓度的菌悬液做三皿平行。细菌经培养后，观察并计数每皿的菌落数，菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，cfu）表示，菌落的观察、计数标准和菌落总数的计算方法按照GB 4789.2-2010进行[18]。

参照李文建[19]和颜艳伟等[20]，根据菌落的形态学特征对菌株进行归类和数量统计，以确定优势菌群。优势菌群定义：在最高稀释度上，菌落数占总菌落数的比例为10%以上。

1.2.3 细菌的纯化、鉴定和序列分析

根据菌落的形态学特征分离细菌，每个种类挑取3个至胰蛋白大豆琼脂培养基上；培养后，将细菌在固体平板划线、培养，并挑取单菌落接种至胰蛋白大豆液体培养基内培养，并再次在固体平板上划线、培养，直至获得纯的菌株。将分离到的细菌在显微镜下进行形态学观察，根据形态学差异将其分为不同类群，每个类群挑取1个单菌落进行16S rRNA序列的测定，送至深圳华大基因科技有限公司完成。测序所用的通用引物是20F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和 1500R(5’-GGTTACCTTGTTACGACT-3’)[21]。 细 菌 的 16S rRNA序列经过校正后，在国际核苷酸序列数据库GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/） 中进行同源性比对。

1.2.4 系统发育分析

在国际核苷酸序列数据库中进行细菌的16S rRNA序列同源性比对时，下载相关模式菌株的16S rRNA序列，利用Clustal Χ软件对16S rRNA序列与模式菌株的16S rRNA序列进行比对，然后用MEGA 5.0 软件构建Neighbor-Joining分子系统进化树，并进行1000次Bootstrap统计学检验[22-24]。

2 结果与分析

2.1 叶面细菌总量的变化

调制期间，云晒1号叶面可培养细菌总量的动态变化结果显示，不同部位的鲜烟叶（收集时间为第1天），细菌总量基本一致（3.30×103～8.60×103）cfu/g；晾制第4天，下部叶和中部叶两个部位烟叶的细菌总量均达到最大；至晾制第7天，上部叶细菌总量达到最大；其后，细菌总量明显下降，调制后期至调制结束时，细菌总量略有升高。调制期间，3个部位烟叶叶面可培养细菌总量的变化趋势较为接近，均呈先升高后降低再略升高的趋势。中部叶和上部叶两个部位叶面可培养细菌总量变化的趋势较为平缓；下部叶叶面可培养细菌总量变化显著，主要表现在晾制前中期（第4天），细菌总量上升约40倍，由初始的5.40×103cfu/g升至2.30×105cfu/g。下部叶的细菌数量总体上明显高于中部叶和上部叶，推测可能是由于下部叶离地距离较近，易受土壤微生物的污染，另外下部叶通风透气性较差，空气微生物易沉降在下部烟叶表面。

表1 调制期间烟叶可培养细菌的总量Tab.1 Total amount of cultivable bacteria on tobacco leaves during tobacco processing cfu/g

2.2 细菌鉴定和多样性分析

自晒黄烟下、中、上三个部位烟叶表面分离到247株细菌，根据显微镜观察到的形态学差异将其分为61个类群，每个类群挑取1株细菌进行16S rRNA基因序列分析，获得45株细菌的16S rRNA基因序列。将测序得到的序列在国际核苷酸序列数据库 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中进行同源性比对。核苷酸序列比对结果表明，调制期晒黄烟3个部位烟叶叶面可培养细菌的种群较为丰富，主要分布在芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、微小杆菌属（Exiguobacterium）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、肠杆菌属（Enterobacter）、γ-变形菌纲细菌（Gamma proteobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、泛菌属（Pantoea）等10个属。其中，分离到的Bacillus属菌株较多，有短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）等。

在NCBI GenBank上进行同源性搜索，得到所测菌株相近种或模式种的16S rRNA序列，利用Clustal Χ软件对这些序列进行比对，构建晒黄烟叶面可培养细菌的系统发育树，将Halobacterium salinarum作为外群，见图1。系统发育分析结果显示，晒黄烟叶面可培养细菌中芽孢杆菌属（Bacillus）细菌形成一较大的进化分枝，提示Bacillus属类群在晒黄烟烟叶调制过程中可能发挥着重要作用。

图1 晒黄烟叶面可培养细菌的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of cultrable bacteria on tobacco leaves

2.3 调制期叶面细菌优势种群的变化

整个晾制期间，自云晒1号烟叶分离到的Bacillus属菌株数量最多，其次是Brevibacillus、Arthrobacter和Enterobacter属菌株，其他属的菌株相对较少。不同部位烟叶在调制期间的细菌优势种群略有差异，总体上以Bacillus属菌株为主。对于新鲜的下部叶，Enterobacter属和Bacillus属菌株较多，其后至调制结束，基本以Bacillus属菌株为主，其次是Brevibacillus属菌株。对于中部叶，整体以Bacillus属菌株为主，新鲜烟叶和晾制第7天分别存在相对较多的Arthrobacter属和Enterobacter属菌株。上部鲜烟叶分离到的菌株情况基本与下部鲜烟叶相同，以Enterobacter属和Bacillus属菌株为主，其后虽有相对较多的Pantoea属菌株，仍以Bacillus属菌株为主。

表2 云晒1号调制期间细菌优势菌群的变化Tab.2 Dynamics of cultivable bacteria on tobacco leaves during tobacco processing

3 结论与讨论

烟草调制期，在烟叶缓慢失水过程中发生着复杂的物理和化学变化。烟叶微生物对烟草调制可产生复杂的作用，例如引起调制期烟叶腐烂变质，烟草特有亚硝胺（tobacco-speci fi c nitrosamine，TSNA）的积累[25]，促进烟叶香气的产生[26]等。烟叶表面微生物有霉菌、细菌、放线菌等，其中细菌占绝对优势[7,27]。

本文首次对我国特色烟叶云南晒黄烟晾制期间叶面可培养细菌的动态变化和多样性进行了研究。结果表明，云晒1号烟叶调制期间，烟叶表面细菌种群较为丰富，主要分布在芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、微小杆菌属（Exiguobacterium）和短芽孢杆菌属（Brevibacillus）等10个属。其中分离到的Bacillus属菌株数量最多，是整个晾制期间的优势细菌类群，其 次 是Brevibacillus属、Arthrobacter属 和Enterobacter属菌株，其他属的菌株相对较少。云晒1号烟叶上的主要细菌优势种群与烤烟烟叶的优势种群基本一致，而与白肋烟的不同。在烤烟的自然醇化和人工发酵期间，Bacillus属菌株是主要的优势种群之一[7,9,10,14,25,27,28]。白肋烟调制期间，Pseudomonas属菌株是主要的细菌优势种群之一，优势种群中未见Bacillus属菌株[28-31]。早在1967年English等发现分离自阔叶烟的Bacillus属菌株能够促进烟叶香气的产生[26]；Bacillus属菌株分别被Fravel等、Lian等和Huang等用于烟草赤斑病、烟草花叶病毒和烟草灰霉病的防治[32-34]；雷丽萍将Bacillussp.WT处理白肋烟，可降低烟叶TSNA含量[35]。由此推测，Bacillus属菌株在晒黄烟调制期可能对烟叶香气产生、病菌防治以及TSNA形成等发挥着一定的作用。

云晒1号叶面细菌总量的变化趋势与烤烟和白肋烟的有所不同。烤烟烘烤过程中，细菌数量呈先升高后明显下降的趋势[29]；白肋烟调制过程中，细菌总量呈逐渐降低的趋势[28]。而云南晒黄烟叶面细菌总量呈先升高后降低再略升高的趋势。这可能与三种烟草的调制方式（主要是叶片失水情况、环境温度和湿度）不同有关。在调制结束时，晒黄烟叶面仍有一定数量的细菌存在，提示叶面细菌的生命活动对晒黄烟的发酵品质也可能产生影响。

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Diversity analysis of cultivable bacteria on leaf surface of yellow sun-cured tobacco during curing

NI Hongmei1,2,LI Xuemei1,XIE Lihua1,MI Qili1,YAO Jianhua1,QIAN Yingying1,CHEN Jianhua1,WANG Yi1,WEI Yunlin2
1 Technology Center,China Tobacco Yunnan Industrial Co.,Ltd,Kunming 650231,China;
2 School of Life Science and Biotechnology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China

Samples of Yunnan yellow sun-cured tobacco leaves were collected during sun-curing.Dynamics and diversity of cultivable bacterial community were investigated.Results showed that total amount of bacteria fi rstly increased,then decreased,and fi nally increased slightly.Bacterial species were relatively rich.About ten genera of bacteria were identi fi ed,includingBacillus,Pseudomonas,Arthrobacter,Exiguobacteriumetc.Bacillusspp.were the dominant bacteria during sun-curing and also the dominant populations on fl ue-cured tobacco leaves.

yellow sun-cured tobacco; curing; cultivable bacteria; dynamic change; diversity

倪红梅，李雪梅，谢丽华，等.晒黄烟调制期叶面可培养细菌的多样性研究[J].中国烟草学报，2015,21（1）

云南中烟工业有限责任公司项目（2013YL01）

倪红梅（1976—），在读硕士，研究方向：微生物学，Email：kunminghmni@126.com

米其利（1981—），在读博士，主要从事烟草生物技术研究，Email：miqiliyn@126.com

魏云林（1969—），博士，教授，Email：homework18@126.com

2014-05-19

：NI Hongmei,LI Χuemei,ΧIE Lihua,et al.Diversity analysis of cultivable bacteria on leaf surface of yellow sun-cured tobacco during curing [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(1)