蒸气爆破预处理芦苇酶解工艺优化及产物分析

朱作华 蔡霞 严理 李智敏 谢纯良 胡镇修 彭源德

摘要：芦苇（Phragmites australis）是一种有潜力的能源作物，为优化芦苇酶解糖化工艺，应用Plackett- Burman试验设计筛选影响芦苇酶糖化的重要参数，通过Box-Behnken设计确定重要参数的最佳水平，应用高效液相色谱仪（HPLC）对糖化过程中的单糖种类及含量进行分析。结果表明，影响芦苇酶糖化的重要参数是H2SO4浓度、Tween-80和MnSO4浓度，最佳工艺参数为H2SO4浓度0.88%、表面活性剂Tween-80添加量0.61%、MnSO4添加量0.26%，在此条件下，8～10 h可以完成糖化，总还原糖浓度达到45.68 mg/mL，同时验证了数学模型的有效性，液相分析表明糖化液中主要的糖种类为葡萄糖和木糖，其含量分别为21.36、16.62 mg/mL，阿拉伯糖、纤维二糖和半乳糖含量较少。

关键词：芦苇（Phragmites australis）；Plackett-Burman设计；Box-Behnken设计；酶解；响应面法

中图分类号：S216.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5387-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.047

Hydrolysate Alalyze and Enzymatic Saccharification Conditions Optimization of Reed by Steam Explosion Pretreatment

ZHU Zuo-hua， CAI Xia， YAN Li， LI Zhi-min， XIE Chun-liang， HU Zhen-xiu， PENG Yuan-de

（Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205， Hunan， China）

Abstract：Reed （Phragmites australis）was a kind of alternative raw material for bio-ethanol production. The important parameters of influencing enzymatic sacharification for reed were screened by Plackett-Burman design. Furthermore， based on Box-Behnken design， the enzymatic saccharification conditions of reed by steam explosion pretreatment were optimized by response surface methodology， and a mathematial model of a second order quadratic equation was developed for reducing sugar conentration. The hydrolysate was alalysed by HPLC. The resutlts suggested that the three important parameters included dilute sulphuric acid， Tween-80 and manganese sulfate concentration. The optimized technologial parameters were as follows： dilute sulphuric acid concentration 0.88%，、Tween-80 concentration 0.61%， manganese sulfate contration 0.26%. The reducing sugar concentration was up to 45.68 mg/mL. The results verified the validity of the mathematical model. The concentrations of glucose and xylose were 21.36 mg/mL and 16.62 mg/mL， respectly. Contents of arabinose， cellobiose and galactose were very low.

Key words：reed（Phragmites australis）； Plackett-Burman design； Box-Behnken design； enzymatic saccharification； response surface methodology

芦苇（Phragmites australis）是多年生草本植物，分布广泛、适应性强、生长快、产量高，不需要施肥，全世界约有1 000万hm2，而我国现有14个芦苇主产区，面积达130万hm2以上[1，2]。目前，芦苇在农村主要用于牲畜的草料和草垫等，工业上主要用作造纸原料[3，4]。芦苇的产量和质量主要取决于当地的生长条件，每公顷产量15～35 t干基，茎杆纤维素含量40%以上，半纤维素含量30%左右，可用于燃料乙醇的生产，是一种很有潜力的可再生能源作物[5-7]。

由于木质纤维素原料本身的理化特性及结构组成的复杂性，酶有效降解纤维素前必须经过预处理过程[8，9]。目前，比较有效的预处理方法包括利用酸、碱等化学预处理和蒸气爆破预处理。酸预处理能够溶解掉半纤维素，但易产生副产物；碱预处理可以更有效地去除木质素，但半纤维素可能变为难溶的聚合物；生物法也可以取得良好的预处理效果，但处理时间较长[10-12]。蒸气爆破法由于具有处理时间短、化学试剂用量少、污染小、能耗低等优点，被认为是木质纤维素原料有效的预处理方法之一。

影响纤维质原料酶糖化的因素很多，且各因素间可能存在交互作用，单因素试验和正交试验得到的结果不够严密。响应面分析法可以设计试验结果与参数变量间的关系，分析一次项、平方项和2个因子间的一级交互作用项的数学模型，近年来已经广泛应用到工艺条件的确定[13-15]。本研究在前期化学预处理、蒸气爆破预处理研究的基础上，应用Plackett-Burman试验设计筛选影响蒸气爆破芦苇糖化的重要参数，然后通过Box-Behnken设计及响应面分析确定芦苇糖化重要参数的最佳水平。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦苇取自益阳市沅江洞庭湖区，经自然风干后剪碎。纤维素酶由高宝公司和湖南尤特尔公司提供，酶活力分别为2 587 U/mL和3 734.64 U/mL，木聚糖酶由广东华芬酶有限公司和湖南尤特尔公司提供，酶活力分别为1 9425 U/mL和9 644 U/mL。硫酸、氢氧化钠、葡萄糖、酒石酸钾钠、PMP等试剂均为分析纯，3，5-二硝基水杨酸为生化纯，甲醇、乙腈为色谱级，甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖为SIGMA-ALDRICH公司试剂。

1.2 仪器与设备

UX6200H型电子天平（日本岛津公司）；Mettler Toledo Delta 320型精密pH计（瑞士梅特勒-托利多公司）；756型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；RH-Q型恒温摇床（金坛荣华仪器制造有限公司）；移液器（德国EPPENDORF公司）；YXQ-LS-50SⅡ型高压灭菌锅（上海博讯实业有限公司）；UltiMate3000型高效液相色谱仪（美国热电公司）；QB-200型蒸气爆破机（鹤壁市正道重机厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 芦苇酶解 称取100 g芦苇样品，加入500 mL稀硫酸溶液浸泡10 h左右，使芦苇样品充分浸湿，滤去滤液，滤渣进行汽爆处理，气爆压力2.0 MPa，维压时间120 s，气爆后原料按一定比例加入蒸馏水，调节pH为5.5，加入适量木聚糖酶和纤维素酶进行酶解，酶解条件为48 ℃、150 r/min，48 h后分别测定总还原糖，取平均值。

1.3.2 Plackett-Burman试验 Plackett-Burman设计是一种有效的两水平试验设计方法，适用于从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的因素。纤维素预处理酶水解工艺中涉及的参数较多，Plackett-Burman适合于本试验设计， 根据前期试验结果和相关文献报道[5，6，16]，本试验选取7个影响因子作为独立考察的因素，见表1。

1.3.3 响应面优化试验设计 在Plackett-Burman试验的基础上，根据Box-Behnken设计原理，对筛选的3个最重要影响因素（H2SO4浓度、Tween-80和MnSO4） 进行进一步优化研究，以酶解液中的总糖浓度为响应值进行响应面分析试验，通过软件计算分析确定重要试验因子的水平，从而获得最佳的芦苇预处理酶水解工艺参数，其他参数为浴比1∶2，酶配比为10%高宝纤维素酶+5%华芬木聚糖酶，0.1%CoCl2，不添加Tween-20。

1.3.4 分析方法 酶解液中还原糖浓度采用DNS法测定[17]；葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖浓度的测定采用高效液相色谱法，使用高效液相色谱仪，检测器为紫外检测器，色谱柱为C18；流动相为0.1 mol/L硫酸铵和乙腈，体积比为81∶19，流速为1.2 mL/min，柱温为30 ℃。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman筛选试验

Plackett-Burman试验设计及结果见表3，利用Design Expert软件对试验结果进行方差分析和系数的显著性检验，试验设计和结果见表4。“Prob>F”小于0.05时，表明该因素是重要的。“Model Prob>F”为0.032 5时，表明该模型是重要的。7个因素的重要性顺序依次为H2SO4浓度、MnSO4、Tween-80、浴比、CoCl2、酶配比、Tween-20。

2.2 响应面试验

Box-Behnken试验设计及结果见表5，其中中心值重复3组试验，利用Design Expert软件对表5中数据进行多元回归拟合，获得响应值总还原糖浓度（Y）的二次多项式回归模型为：Y=44.25-4.76×A-0.15×B+1.96×C+0.6×A×B+0.18×A×C-0.44×B×C-7.5×A2-0.62×B2-0.85×C2，进一步对回归方程进行方差分析和显著性检验，见表6。回归模型方程的回归系数为R2=0.98，方差分析显示“Model Prob>F”为0.000 3，说明该模型是重要的，表明试验点数据的拟合方法是合理的，该模型可用于预测芦苇原料预处理后酶解糖化过程中总还原糖浓度的变化。显著性水平（P<0.05）条件下，因素A和C对总还原糖糖浓度的线性效应显著，因素B不显著；因素A2对总还原糖浓度的曲面效应显著，B2和C2不显著；AB、AC、BC的交互作用不显著。

通过上面多元回归方程作响应曲面及其等高线图，结果见图1。

2.3 最佳工艺条件确定与验证

在前面响应面分析的基础上，通过软件模拟，当H2SO4浓度为0.88%，Tween-80添加量为0.61%，MnSO4添加量为0.26%时，总还原糖浓度达到最大值46.40 mg/mL。为了检验模型预测的准确性，依据该参数处理芦苇杆，其他参数不变，3次重复，总还原糖浓度分别达到45.05、45.79、46.20 mg/mL，平均值为45.68 mg/mL。试验值与模拟值基本一致，表明该优化模型有较高的可靠性。

2.4 芦苇酶水解过程产物分析

由图2可以看出，对芦苇酶水解过程的产物进行分析，0～8 h总还原糖浓度快速升高，反应进行到8 h时酶解液中总还原糖浓度达到最大值45.68 mg/mL，其后基本保持不变。HPLC检测糖化液组分，结果表明，糖化液中葡萄糖浓度最高为21.36 mg/mL，其次为木糖16.62 mg/mL，阿拉伯糖、纤维二糖和半乳糖含量较少。随着糖化时间的增加，葡萄糖、木糖含量的变化趋势与总还原糖浓度的变化趋势相似，阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖含量在整个反应测定的时间段内变化不大。

3 小结

本研究在前期蒸气爆破预处理试验及单因素试验的基础上，基于Plackett-Burman试验设计原理，对影响芦苇糖化的因素重要性进行筛选，获得影响芦苇糖化的最重要的三个因素为H2SO4浓度、Tween-80添加量和MnSO4添加量；进一步应用Box-Behnken试验设计，以总还原糖浓度为响应值进行响应面分析，建立工艺数学模型，在此基础上进行了工艺优化模拟。结果表明，H2SO4浓度和MnSO4添加量是影响芦苇糖化的重要因素。最佳工艺条件为H2SO4浓度0.88%，Tween-80添加量0.61%，MnSO4添加量0.26%，糖化时间仅需8～10 h，总还原糖浓度达到最大值45.68 mg/mL，试验值与模拟值基本一致，表明该优化模型有较好的可靠性，具有一定的指导意义。液相色谱分析表明，糖化液中糖种类主要为葡萄糖和木糖，其含量分别为21.36、16.62 mg/mL，还含有少量的阿拉伯糖、纤维二糖和半乳糖。

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