重组人骨形态发生蛋白-2的制备及成骨活性表征

李贵龙，王靖，刘昌胜



重组人骨形态发生蛋白-2的制备及成骨活性表征

李贵龙，王靖，刘昌胜

（华东理工大学教育部医用生物材料工程研究中心，上海 200237）

骨形态发生蛋白-2（BMP-2）是重要的骨诱导生长因子，是提高骨修复材料活性和临床骨修复效果的有效手段和关键物质。由于BMP-2在体内含量低，依靠从动物体内提取难以满足临床需求。本文研究满足临床需求的BMP-2的制备方法，并评价其生物活性。采用密码子优化方法，并通过进一步更换其中部分核苷酸编码，得到优化的hBMP-2基因的DNA序列，制备大肠杆菌rhBMP-2菌株，通过发酵及工艺优化，获得BMP包涵体，经分离纯化与复性，制备出高纯度的rhBMP-2。测定C2C12细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性来表征单倍体和二倍体BMP-2的成骨活性，发现二倍体rhBMP-2的成骨活性明显高于单倍体rhBMP-2，并且随着BMP-2浓度增加，碱性磷酸酶活性上升。体内动物异位成骨实验发现rhBMP-2肌带植入小鼠体内3周后，取出的异位骨颗粒鲜艳饱满，骨结构完整；HE切片和Masson三色切片都显示出良好的异位成骨效果。此方法制备的rhBMP-2具有良好的诱导成骨分化能力，可用于骨组织修复，满足临床需要。

骨修复；生物医学工程；蛋白质；蛋白质复性；骨形态发生蛋白-2；原核表达

引 言

近年来，因疾病、创伤、人口老龄化等原因导致的骨损伤患者数量剧增。骨缺损修复主要采用自体骨或同种异体骨移植以及人工骨替换等方法。其中自体骨移植因其良好的骨诱导性和生物相容性，迄今仍是骨修复的“金标准”。但由于来源受限、供骨部位易感染等问题，临床应用受到限制；而异体骨则存在不同程度的免疫排异反应及潜在的病源传播风险。尽管目前已经有不少骨修复材料获得临床应用，但单纯材料生物活性普遍不足，严重影响了其临床使用效果。

对骨生长和修复有促进作用的骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）生长因子的发现为提高骨修复材料的活性提供了有效的手段。BMP属于转化生长因子TGF-β超家族成员，于1965年首次被发现。到目前为止，已发现20余种BMP成员[1-2]。其中BMP-2研究最为广泛，其诱导成骨作用已得到证实，并且已分别获美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMEA）批准用于临床，具有广阔的应用前景[3-6]。

BMP是一种疏水性非胶原酸性糖蛋白，存在于动物骨组织中，但含量极低，每千克鲜骨中仅分离出几微克BMP，且分离过程繁杂，纯度低，重复性差，质量控制困难，难以满足临床需求[7]。利用基因重组技术不仅可以实现规模化生产，还可以避免免疫排斥反应，具有极佳的发展前景。目前，BMP-2可以采用真核细胞和原核细胞两种系统表达。真核细胞表达系统使用哺乳动物细胞，其表达产物可以糖基化，有更好的翻译后修饰，活性相对较高。目前的国外产品大多采用真核表达体系制备。但真核体系表达量低，因此表达产物回收及纯化均困难，导致生产成本很高。目前国外BMP产品的价格十分昂贵，临床推广难度很大。与真核表达系统相比，原核细胞表达系统具有表达效率高、对培养环境耐受性强、易于控制，产物稳定、生产成本低等优点[8-15]，更利于临床推广。但其主要问题是较难正确加工和折叠形成有活性的蛋白质，特别是可重复性的复性和纯化的难度很大[16-17]，致使大部分工作停留在实验室水平，无法实现产业化。

本文通过截取编码rhBMP-2羧基端氨基酸肽段的rhBMP-2的cDNA制备大肠杆菌rhBMP-2菌株，通过发酵及工艺优化，获得BMP包涵体，经分离纯化与复性，制得高纯度的rhBMP-2，并在体外细胞实验和体内动物实验中考察了所制备的rhBMP-2的诱导成骨活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 ①LB培养基配制：10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母浸出粉，5 g·L-1NaCl；氨苄青霉素含量为100 μg·ml-1；②包涵体裂解液配制：6 mol·L-1Gu-HCl（盐酸胍），20 mmol·L-1PBS（磷酸缓冲液），10 mmol·L-1DTT（二硫苏糖醇）；③包涵体复性液配制：20 mmol·L-1Na2HPO4·12H2O，1.5 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O、140 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、 1 mmol·L-1谷胱甘肽；④TE缓冲溶液配制： 6 mmol·L-1Tris，10 mmol·L-1EDTA；⑤麻醉剂（3%水合氯醛溶液）；⑥4%中性甲醛固定液；⑦可吸收性明胶海绵（南京金陵药业股份有限公司），硝基苯磷酸（PNPP-Na，中国上海生工生物有限公司）。所有试剂均为国产分析纯。

1.1.2 实验动物 C57/BL雄性小鼠，18～20 g，SPF级别，由上海中医药大学科技实验中心提供。

1.2 rhBMP-2的制备[18]

1.2.1 hBMP-2基因的DNA序列优化 根据大肠杆菌密码子使用频率采用密码子优化软件初步优化hBMP-2 的cDNA序列，再根据经验值计算，进一步更换其中部分核苷酸编码，得到优化的hBMP-2基因的DNA序列。

1.2.2 重组载体的构建 全基因合成hBMP-2基因DNA序列，酶切后插入载体pBV220，获得优化的hBMP-2表达质粒，经酶切和测序验证插入片段与设计相符。

1.2.3 工程菌的构建、验证和保存 以常规氯化钙法采用分子克隆技术制备感受态表达系统。随后用所得的表达质粒转化大肠杆菌菌株，在抗性平板中挑取单菌落，培养并抽提质粒，酶切测序。挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在气浴振荡器中培养15 h（温度30℃、转速180 r·min-1），然后冰浴条件下加入无菌甘油，分装后在-80℃冰箱保存。

1.2.4 工程菌的培养 从含正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养液摇瓶中；在摇床中培养8 h（温度30℃、转速180 r·min-1），再按体积比为1:10的比例将培养物接种到LB培养基中培养4 h（条件：pH 7.0±0.2，温度30℃，转速180 r·min-1）。随后升温至42℃进行诱导，继续培养6 h。结束培养，在（4±2）℃温度下离心分离（转速7500 r·min-1）收集菌体，裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.2.5 包涵体的提取和洗涤 将收集的菌体，与TE缓冲溶液按1 g:10 ml的比例混合，再按1 g:1 mg的比例与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，离心分离（转速10000 r·min-1）并收集沉淀。加入洗涤溶液（1 g沉淀物/20 ml洗涤液），搅拌2 h后，在（4±2）℃下离心分离，收集沉淀物。沉淀物用0.5%曲拉通水溶液洗涤数次后，加入10 mmol·L-1的Tris（pH 7.5）溶液（1 g沉淀物/20 ml Tris），清洗后离心收集沉淀，得包涵体。

1.2.6 包涵体的裂解、复性 以1g包涵体/10 ml的比例加入裂解液。在（4±2）℃下，搅拌裂解8 h，然后离心[转速10000 r·min-1，温度（4±2）℃]30 min，弃沉淀，取离心上清液加入含复性助剂的复性液中，稀释至蛋白含量为0.1 mg·ml-1，复性7 d。

1.2.7 蛋白纯化 采用离子交换色谱、亲和色谱、分子排阻色谱的方法，按常规的洗脱方法从复性 液中回收有活性的融合蛋白二倍体。然后在-30～7℃下冻干，得到目标蛋白。具体工艺流程如图1 所示。

图1 rhBMP-2制备工艺流程

1.3 碱性磷酸酶（ALP）活性测定

将C2C12细胞以1.2×104个·孔-1的密度接种在96孔板中，培养24 h后，细胞完全贴壁，更换培养基，分别加入2 ml含有不同浓度的单倍体和二倍体BMP-2（0～12 μg·ml-1）的培养基。培养72 h后，去除培养基。在每孔中加入50 μl 1%乙基苯基聚乙二醇溶液（NP-40），室温下裂解细胞1 h。获取裂解液，加入0.1 ml 1 mg·ml-1的-硝基苯基磷酸盐溶液（PNPP-Na，pH9.0）和0.1 mol·L-1甘氨酸、1 mmol·L-1MgCl2·6H2O组成的混合液，置于37℃孵育15 min。孵育结束后，每孔加入0.1 ml 0.1 mol· L-1NaOH，用酶联免疫检测仪在405 nm 处测定ALP 吸光值。裂解液中总蛋白的含量采用microBCA试剂盒（碧云天生物科技，江苏，中国）测定。建立BSA蛋白标准曲线并测定 562 nm处的吸光值，计算获得总蛋白的量。ALP活性结果由405 nm 处吸光值与相应总蛋白含量的比值来表示。

1.4 rhBMP-2异位成骨

将明胶海绵剪裁成1 cm×1 cm×0.5 cm块状置于24孔板，滴加50 µg的rhBMP-2；充分吸附后，放入真空冷冻干燥机冻干12 h，取出放-20℃冰箱备用。

体内植入实验在无菌环境下操作，所用的所有实验器具事先经灭菌处理。将SPF级C57/BL小鼠按0.15～0.2 ml/18～22 g比例腹腔注射水合氯醛麻醉剂。将小鼠固定，右后腿部内侧去毛，75%乙醇溶液擦拭表皮消毒。用手术剪纵向切口约3 mm，将肌袋内软组织分开后植入样品，手术线逐层缝合。手术后的小鼠在无菌环境下正常饲养。

术后3周，将实验小鼠处死。解剖右后腿，从肌袋中取出骨样组织。附带周围少量软组织一同浸泡在4%福尔马林溶液中固定24 h，然后在30%甲酸-福尔马林溶液中脱钙72 h。脱钙后的标本经洗涤、乙醇法梯度脱水、二甲苯透明处理、浸蜡、包埋、切片等工序后，进行组织染色。本文选用苏木素-伊红（HE）和Masson对新生的骨样组织进行染色。染色后的标本在倒置显微镜下观察骨形成情况。

2 结果与讨论

2.1 rhBMP-2制备

天然的BMP-2以二聚体形式存在，2个单体间通过二硫键结合。每个BMP-2单体含有114个氨基酸，相对分子质量约13×103。本研究中，采用密码子优化方法，并通过进一步更换其中部分核苷酸编码，经合成得到优化的hBMP-2基因的DNA序列。构建并获得基因优化的表达质粒pRB-BMP2-1，其长度为4013 bp；由图2可以看出，经酶切和测序验证，插入片段与设计一致。

图2 rhBMP-2基因优化的表达质粒

图3 hBMP-2基因的DNA序列优化

本研究采用分子克隆技术，将优化基因克隆入表达载体并转化大肠杆菌，获得表达rhBMP-2的工程菌（图3）。将rhBMP-2工程菌株进行高密度发酵和温度诱导表达。离心分离收集菌体，经裂菌、超声、洗涤等步骤后获得以包涵体形式存在的BMP-2二聚体。将包涵体变性溶解，经离子交换柱色谱、亲和色谱、分子排阻色谱后，可获得高纯度的重组人骨形态发生蛋白（rhBMP-2）。本研究所制备的rhBMP-2的氨基酸肽链序列如下：Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Glu Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg。

图4的聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，对比诱导前的重组菌及不含质粒的出发菌，菌体裂解后在相对分子质量13×103处出现清晰条带，证明表达产生了目标蛋白。经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95%；其二聚体相对分子质量约为26×103；经HPLC鉴定其纯度超过95%，并且N末端与C末端测定均与理论值一致。每批培养物的得率可达5.3 mg·L-1。

图4 rhBMP-2聚丙烯酰胺凝胶电泳图

2.2 rhBMP-2诱导成骨活性

采用以大肠杆菌为宿主细胞的原核表达系统制备rhBMP-2，具有操作简便、成本低、产量高等优点。但其最大问题在于表达产物为不可溶且无生物活性的包涵体，必须经过进一步纯化以及变性-复性过程才能获得高纯度的活性蛋白。而BMP-2的复杂二聚体结构和强疏水性特点，使得其适用的复性和分离纯化方法受限。本研究采用透析法复性。经过复性，rhBMP-2的二硫键配对成3个分子内二硫键和1个分子间二硫键，与天然BMP-2的二聚体形式一致，从而保证其具有诱导成骨活性。

碱性磷酸酶(ALP)广泛存在于人体骨骼和肝脏组织中，是成骨样细胞分化成熟的重要标志之一，其活性高低可反映出细胞成骨转化及矿化能力。一般采用ALP活性作为体外评价细胞早期成骨分化的指标。本研究通过测定C2C12细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性来表征单倍体和二倍体BMP-2的成骨活性。由图5可知，二倍体rhBMP-2的成骨活性明显高于单倍体rhBMP-2，并且随着BMP-2浓度增加，碱性磷酸酶活性上升。

图5 单倍体和二倍体rhBMP-2蛋白的ALP活性比较

将所制备的rhBMP-2负载于医用明胶海绵上，植入小鼠肌袋内观察其诱导异位成骨的情况。图6为植入3周后取出的异位骨标本，肌袋内明显可见形成新生骨样组织，颗粒饱满，质地坚硬，长度7～10 mm，环直径约5 mm，颜色呈血红色。进一步组织学分析，由图7（a）、（b）HE染色中看出在横纹肌组织中出现骨组织，包括骨小梁、红骨髓和脂肪空泡，并且骨小梁已经相互联结，形成稳固的骨结构；而由图7（c）、（d）Masson三色染色图中可见，新生骨组织中深蓝与深红色相间，深蓝色区域中出现大量骨陷窝和密集排布的骨小梁，中间还有部分的骨髓空腔，四周充满红细胞和脂肪细胞，说明骨组织趋于成熟。组织学分析表明，本方法所制备的rhBMP-2具有良好的骨诱导活性。

3 结 论

rhBMP-2是重要的促进骨修复生长因子，实现规模化可控制备对提高临床治疗水平具有重要意义。本文采用优化的、适合大肠杆菌表达系统的rhBMP-2的DNA序列，通过发酵及工艺优化，获得BMP包涵体，经分离纯化与复性，制得高纯度的二倍体rhBMP-2。体外细胞碱性磷酸酶活性检测及体内异位成骨实验表明，所制备的rhBMP-2具有良好的成骨活性，有望用于骨组织修复，满足临床实际需要。

图6 新生异位骨颗粒

图7 rhBMP-2诱导异位成骨的HE和三色染色

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Preparation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 and investigation of osteogenic activity

LI Guilong, WANG Jing, LIU Changsheng

Engineering Research Center for Biomedical Materials of Ministry of EducationEast China University of Science and TechnologyShanghaiChina

Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), one of the important osteoinductive growth factors, is an effective and crucial cytokine for clinic bone regeneration as well as bioactivity improvement of bone substitute. However, extraction of BMP-2 from animals can hardly meet the clinic requirements due to its very low content. This work studied the preparation of BMP-2 to meet the clinical needs, and evaluated its biological activity. Firstly, DNA sequence of optimized hBMP-2 gene was obtained to prepare rhBMP-2 strains of.using codon optimization method with further replacement of the partial nucleotide coding. Then, through fermentation and process optimization the BMP inclusion body was acquired. After separation, purification and renaturation, rhBMP-2 of high purity was prepared.cell experiments, the activity of alkaline phosphatase (ALP) in C2C12 cells was measured to characterize the osteogenic activity of haploid and diploid BMP-2. It was observed that the osteogenic activity of diploid rhBMP-2 was significantly higher than that of haploid rhBMP-2, and the activity of alkaline phosphatase increased with the increase of the BMP-2 concentration.ectopic bone experiment, after rhBMP-2 was implanted into the muscle of mice for 3 weeks, the ectopic bone granules were bright and fresh, and the bone structure was complete. HE and Masson’s trichrome stainings showed good ectopic bone formation. It can be concluded that the rhBMP-2 prepared using this method can well induce osteogenic differentiation, and can be used for bone tissue repair to meet the clinical needs.

bone regeneration; biomedical engineering; protein; renaturation; bone morphogenetic protein-2; prokaryotic expression

2015-06-04.

Prof. LIU Changsheng, liucs@ecust.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20150825

R 318.08

A

0438—1157（2015）08—3183—06

刘昌胜。

李贵龙（1988—），男，硕士研究生。

国家重点基础研究发展计划项目（2012CB933600）。

2015-06-04收到初稿，2015-06-08收到修改稿。

supported by the National Basic Research Program of China (2012CB933600).