合成生物学研究进展

林章凛，张艳，王胥，刘鹏



合成生物学研究进展

林章凛，张艳，王胥，刘鹏

（清华大学化学工程系，北京100084）

合成生物学是以工程化设计思路，构建标准化的元器件和模块，改造已存在的天然系统或者从头合成全新的人工生命体系，实现在化学品合成（包括材料、能源和天然化合物）、医学、农业、环境等领域的应用。人们利用基本的生物学元件设计和构建了基因开关、振荡器、放大器、逻辑门、计数器等合成器件，实现对生命系统的重新编程并执行特殊功能。模块化处理生物的代谢途径，并在底盘细胞上进行组装和优化，可以实现大宗化学品和精细化学品的合成。目前人们已经在丁醇、异丁醇、青蒿素和紫杉醇等化合物的生物合成上取得了重要进展。近年来还发展了多种基因组编辑和组装技术，可精确地对基因组进行编辑，人们还成功地合成了噬菌体基因组、支原体基因组和酵母基因组。在未来的50～100年内，合成生物学将对人类的医疗、化学品制造（含药品）、军事产生渐进性的、渗透性的但颠覆性的意义。

合成生物学；生化工程；代谢；元器件；模块；基因线路；化学品合成；基因组

引 言

合成生物学是以系统生物学的研究为基础，使用“问题导向”和“自下而上”的工程化设计思路，构建标准化的元器件和模块，改造已存在的天然系统以获得具有新功能的生物体系，或者从头合成全新的人工生物体系，其示意图如图1所示。合成生物学在经典的基因工程和代谢工程的基础上整合了工程学、电子学、计算机学、数学等多门学科的内容，加深人们对细胞机理、调控网络、生物进化等生命本质的认识，还能实现对生命系统的重新编程，执行特殊的生物功能。合成生物学在化学品合成（包括材料、能源和天然化合物）、医学、农业、环境等领域都有重要的应用价值。

“合成生物学”给生物技术产业带来了空前的变革，被誉为可改变世界的十大新技术之一[1]。合成生物学的发展引起了科学界和政府的高度重视。如美国国防部最近公布了未来五年的科研战略部署，包括了合成生物学在内的六大“颠覆性技术”。他们认为合成生物学可用于军用药物的快速合成、生物病毒战、基因改良和人体快速损伤修复等。中国2011年开始规划合成生物学研究计划，到目前部署了10个合成生物学国家重点基础研究发展计划（973计划）项目和1个国家高技术研究发展计划（863计划）重大项目。工作重点在元器件库、化学品与材料（包括药品和天然化合物）的合成、肿瘤诊治、微生物和植物抗逆、生物固氮等研究。由于启动比较晚，整体的研究尚处于跟踪阶段。但是可以预见，合成生物学研究将对国家的经济和社会发展带来重大意义。

1 基本元件

启动子、基因编码序列、终止子、转录调控蛋白因子、核糖体结合位点（RBS）、调控小RNA分子等都是合成生物学的基本元件。人们开始系统定量表征自然界的天然元件，并开发了许多基于天然元件的突变人工元件。除了上述最基础的元件外，人们还开发了一些新型的元件，例如基因间序列元件、DNA位点标签元件、RNA适配子元件等，并着力不断扩大这些人工元件的种类和数量。这些元件共同构成合成生物学的元件库。如图1所示，借助电路设计和计算机编程的设计思路，可以进行人工理性设计，把这些标准化的元件组装成功能模块或者更为复杂的基因线路[2]。模块化的基本元件和计算机的辅助设计，能高效地构建出功能体系，减少开发时间和成本[3]。

图2给出了一个具体的基因表达模块例子。启动子是基因起始转录的地方，启动子的强度控制了基因的表达量，终止子在基因的末尾处，负责停止基因的转录过程，也是重要的合成生物元件。人们对启动子进行了工程化的改造，可以构建一系列不同强度或诱导时间的人工启动子，实现对基因表达的精细调控[4-5]。与启动子改造工作类似，人们也构建了人工终止子元件，这些人工终止子具有序列多样性，终止强度也不同，有利于设计和构建合成模块[6]。核糖体结合位点（RBS）是翻译的起始位点，使用不同序列的核糖体结合位点（RBS），能够在翻译层次对基因进行调控[7]。这些启动子、RBS、基因编码序列、终止子构成了一个基础的表达模块，可以通过DNA克隆或者直接化学合成。转录调控因子（激活因子或抑制因子）是一种能与DNA序列特异性结合并且调控基因转录的蛋白，大部分转录调控因子可以直接感受信号，少部分调控因子需要借助其他信号传导系统对信号产生响应，在接受信号后调控因子对基因产生激活或抑制的调控作用。

2 基因线路

近年来，人们利用基本元件开发了各种基因线路，可以在生物体内实现信息处理，例如基因开关、振荡器、放大器、逻辑门、计数器等[2]，构建的原理在DNA水平上与图2类似。以下是一些代表性的基因线路的研究工作。

核糖开关Riboswitch是天然存在的转录后层次调控的基因开关，通常存在于代谢基因mRNA的非编码区域（UTR），能够感知小分子代谢物的信号，与小分子代谢物结合后改变RNA的二级结构，从而调控代谢基因的表达。人们可以对核糖开关进行理性设计，通过体外或体内的高通量的筛选方法，获得小分子配体特异性响应的核糖开关[8]。核糖开关可用于设计新型的分子传感器，例如利用核糖开关控制报告基因的表达，将酶学信号转化为更易检测的信号。也可以将核糖开关整合进更复杂的基因线路中实现调控作用。

除上述基因开关外，研究人员还开发了更复杂的基因开关系统。例如，美国波士顿大学的James Collins借鉴电子工程的设计思路，在生物体内构建了转录水平的双稳态开关。双稳态开关由两个组成型启动子和两个抑制因子组成，两个启动子中的任一个都被另一个启动子所转录的抑制因子所抑制[9]。这个双稳态开关的结构简单，所含基因数和顺式调控元件少，却能在很宽的范围内达到双稳态调节，而且“鲁棒性”（robustness）很好，对基因表达的内在波动不敏感，不容易出现两个状态间的随机翻转。在没有启动子诱导物时，开关可能处于“开”或“关”两种状态中的任意一种，但是只要加入诱导物激活相应抑制因子的表达，抑制当前处于激活状态的启动子，就能将开关调节至另一种状态。这样的合成基因线路有高度简化和控制度高的特点。

美国加利福尼亚大学的Christopher Voigt教授研究组利用合成生物学的思路设计了一种“大肠杆菌拍照技术”[10]。通过将外源基因和大肠杆菌中的双组分信号传导系统结合，在大肠杆菌中构成了一个光敏元件。含有该光敏元件的大肠杆菌，在没有红光照射时，会生成黑色物质；而在有红光照射时，会保持原色。通过控制光照，可以产生具有清晰对比度的二维图像，实现给大肠杆菌“照相”的目的。这是首次关于具备图像处理功能的基因双稳态线路的报道，获得了人们的重点关注和广泛报道。

美国普林斯顿大学的Michael Elowitz和Stanislas Leibler用了3个转录抑制系统相互抑制的关系理性设计了振荡器。第1个抑制因子LacI抑制第2个抑制因子基因的转录，第2个抑制因子TetR抑制第3个基因，最后CI抑制第1个抑制因子LacI的转录，完成循环。振荡器的报告蛋白GFP也受到TetR的抑制，振荡器实现了“人工时钟”的功能，周期性地诱导表达绿色荧光蛋白[11]。每个周期为几个小时，比细胞的分裂周期慢，说明振荡器可以在一代代细胞中传导信号。

在基因线路中使用正反馈调节系统可以构建生物“放大器”。伊利诺伊大学香槟分校的Goutam Nistala等使用P启动子和LuxRΔ2-162构建了“放大器”，在这个系统中LuxRΔ2-162能激活P启动子，是正反馈信号。研究人员通过单组分的四环素感知系统和双组分的天冬氨酸感知系统，检测了“放大器”的效果，发现“放大器”对四环素信号和天冬氨酸信号的放大效果都很明显[12]。“放大器”可以提高对诱导信号的敏感度和输出基因的最大表达量，可以用于构建更复杂的合成基因线路。

逻辑门是用于构建合成生物学数字器件的重要组成部分。伦敦大学帝国理工学院的Martin Buck研究小组在大肠杆菌中构建了的异源模块。基因线路中包含由不同的启动子控制的基因和基因，输出为54依赖的启动子，只有当和都被表达时启动子才被激活，因此形成了数字AND门的功能[13]。利用类似的设计思路，研究人员还将AND门与NOT门组合构建了NAND门。这是采用具有正交性生物元件为基础的工程化模块构建方法，基因逻辑门器件有工程化的可预测特性。

T7噬菌体的RNA聚合酶（T7 RNAP）可以被分割成两个部分，用于构建逻辑门。分割后的部分分别由不同的诱导型启动子控制，只有当两个启动子都被诱导时才能形成完整的有功能的T7 RNAP，构建出转录水平的AND门[14]。T7 RNAP进一步还可以分割成3部分，构建出三信号输入的AND门[15]。T7 RNAP和宿主菌大肠杆菌中不同的σ因子组合还能构建出更多信号输入的调控模块[16]。

合成模拟基因线路可以用来构建模拟数字电路，用现代计算的方法来对细胞进行编程。细胞计数器可以用来完成复杂的程序。细胞计数器可以用于精确调控生物分子过程，有效地维持代谢和生长，对合成生物学有重要意义。2009年George Church和James Collins合作报道了用大肠杆菌实现最高三次计数的“计数器”[17]。计数器利用诱导启动子和RNA调控元件等在转录层次和翻译层次实现信号响应，然后利用重组酶实现DNA特定位点之间的反转，构建出DNA记忆单元，记忆结果还可以稳定遗传至后代细胞中。2013年麻省理工学院的Rahul Sarpeshkar和Timothy Lu等利用3种转录因子构建了可执行复杂计算能力的合成模拟基因线路，能进行模拟传感和加法、除法、对数和平方根计算[18]。例如分别通过两个启动子表达绿色荧光蛋白GFP，可以计算两个诱导物输入信号的加法运算。使用复杂的模拟基因电路可以显著改变细胞对信号感应、基因表达、计算和控制的效果。

3 化学品合成

生物代谢的多样性为发展生物制造提供了理论基础。将来源不同的生物制造相关的代谢途径模块化，并在底盘细胞上进行组装，设计合适的生物合成途径，提高代谢途径的效率，降低大规模生物催化反应的成本。在化学品合成领域，合成生物学有别于传统代谢工程，主要体现在如下几个方面：①合成生物学开始大规模使用跨种属的基因组合；②使用人工元件对合成通路进行优化，例如采用不同强度的启动子或基因间序列优化基因的表达量，从而达到优化代谢通路和提高产品产量的目的；③可以根据天然酶反应和化学逆合成分析而设计自然界不存在的合成通路；④利用合成生物学的组装工具能把不同组合的大片段DNA快速组装成完整代谢通路，进行测试。

3.1 正丁醇和异丁醇

在大宗化学品的生物合成方面，最有代表性的工作是美国加州大学洛杉矶分校的James Liao研究组的丁醇类物质的合成生物学研究。丁醇和异丁醇是重要的基础化工原料，也是一种极具工业潜力的生物燃料，用以替代传统的化石燃料，其热值及辛烷值与汽油相当，远高于乙醇。研究人员使用了合成生物学的方法在工程菌株中构建丁醇和异丁醇的合成通路，实现了丁醇和异丁醇的生物生产。

野生型梭状芽孢杆菌（）可以首先生成丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A，然后再经过一系列的反应生成正丁醇。但是目前梭状芽孢杆菌不是工业菌株，不适用于大规模工业发酵的应用，德国马尔堡大学的Rudolf Thauer研究组将梭状芽孢杆菌的正丁醇合成通路引入到大肠杆菌，在大肠杆菌中构建了正丁醇的合成通路。然而来源于梭状芽孢杆菌的丁酰辅酶A脱氢酶电子传递黄素蛋白（Bcd/Etf）复合体无法在大肠杆菌中进行有效的活性组装[19]，导致大肠杆菌工程菌株的正丁醇产量远低于野生型梭状芽孢杆菌。James Liao研究组成功地在大肠杆菌菌株中使用了梭状芽孢杆菌的反式- 2-enoyl-辅酶A（-2-enoyl-CoA）还原酶的通路来替代Bcd/Etf复合体的巴豆酰基辅酶A还原通路，最终有效地增加了正丁醇的产量，达到了800～1600 mg·L-1·d-1，远远超过使用依赖Bcd/Etf的正丁醇合成途径的产量（150 mg·L-1·d-1）[20]。虽然目前通过生物法生产的正丁醇产量还不足以应用在大规模工业发酵行业，但是利用合成生物学的改造方法，有望在不远的将来实现正丁醇生物合成的工业生产。

在异丁醇的生物合成技术方面，James Liao研究组在大肠杆菌中引入两个异源酶，分别是来源于乳酸乳球菌（）的2-酮异戊酸脱羧酶KivD和来源于酿酒酵母（）的乙醇脱氢酶AdhA，在大肠杆菌缬氨酸合成通路的一个中间代谢产物（2-酮异戊酸）节点上将碳通量分流进入异丁醇的合成通路，实现大肠杆菌的异丁醇的生物合成[21]。此外通过应用PLlacOI启动子过表达基因增加了上游途径中2-酮异戊酸的表达量，使大肠杆菌的异丁醇产量达到22 g·L-1[21]。实验室水平的进一步发酵条件优化可以将异丁醇的产量提高到55 g·L-1[22]。

3.2 青蒿素

合成生物学技术采用绿色、可持续发展的方式规模化生产天然化合物，是未来天然化合物制备的发展方向之一。美国加州大学伯克利分校化学与生物分子工程系的Jay Keasling教授在天然化合物合成生物学方面做出了突出贡献。2006年，Jay Keasling课题组在酵母细胞中设计并整合了青蒿酸的生物合成途径，在基因工程的原理上引入了模块化设计的理念，利用之前设计的甲羟戊酸途径模块、前体法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）合成模块、紫穗槐-4, 11-二烯合成模块共同构成青蒿酸生物合成代谢通路。通过对各模块关键酶特别是P450酶和代谢通路的优化，目前已经成功利用微生物实现了疟疾治疗药物青蒿素的高效生产[23-24]。其中，代谢通路的优化，主要基于一种调节多基因操纵子中基因相对表达量的方法，即利用可调基因间序列（tunable intergenic regions，TIGR）在转录后层次对基因表达进行调控[25]。2013年，Christopher Paddon等在Jay Keasling成果的基础上，引入来源于黄花蒿植物的脱氢酶和细胞色素P450酶，进一步将青蒿素的产量提高到工业化水平[26]。合成生物学技术对青蒿素的成功制备不仅可能解决该药物来源窄、价格昂贵等问题，还能保证生产过程不受环境和土地的制约，稳定世界市场上青蒿素的供应。

2009年，Jay Keasling课题组将工程化的人工蛋白支架用于代谢工程，利用蛋白支架与同源多肽配体的特异性结合，将代谢途径的相关酶以设定的方式在空间上进行排列整合，提高反应过程中代谢中间产物的局部浓度，进而提高代谢产物的产量[27]。该方案还解决了异源代谢通路在工程菌中缺乏调控机制所导致的代谢流失衡的问题。该技术成功优化了甲羟戊酸生物合成途径中3种酶的空间布局和数量配比，使甲羟戊酸产量提高77倍，同时降低了对酶表达量的需求，减轻了工程菌的代谢负担。Jay Keasling课题组进一步利用该策略使得葡糖二酸的产量在原已高产的基础上又提高至3倍的生产水平，并设想其成果对其他代谢途径的代谢流微调控具有通用性和可设计性。

3.3 紫杉醇

紫杉醇广泛用作抗癌药物，但是天然紫杉醇类物质产量有限。2010年，麻省理工学院的Gregory Stephanopoulos课题组成功地在大肠杆菌中合成了紫杉醇的前体物紫杉二烯[28]。通过开发多元模块代谢工程的方法，将紫杉醇药物中间体紫杉二烯代谢途径分成两个模块，宿主菌自身上游合成IPP（isopentenyl pyrophosphate）的MEP（methylerythritol- phosphate）途径和异源下游萜类合成途径，并通过不同拷贝数（单拷贝基因组整合，质粒pSC101、p15A、pBR322）、不同启动子（Trc、T5、T7）的组合分别对两个模块的代谢流进行微调，优化紫杉烯合成的代谢平衡，减少中间抑制物吲哚的积累。通过Trc启动子控制4个限速酶基因（--）的表达并整合到染色体上，优化了上游MEP途径，通过T7启动子在质粒pSC101上表达异源GGPP合酶基因和紫杉烯合酶基因优化了下游萜类合成途径。最终紫杉二烯的产量提高15000倍，1 L发酵罐中的产量达到1 g·L-1。这种多元模块代谢工程的方法将整个代谢途径分为多个小的模块，并进行分别调节，可以有效地在一个较小的组合范围内获得优化的代谢流平衡，为紫杉醇及萜类天然产物的大规模生产奠定了基础。

3.4 无细胞合成技术

弗吉尼亚理工学院和州立大学的Percival Zhang[29]系统地阐述了“基于无细胞合成酶的生物转化途径”的概念，在体外组装大量酶和辅酶以实现复杂的生物转化。这种无细胞合成酶催化体系具有反应条件较温和、易于调控、产率高的特点。该课题组成功构建了由13个酶和辅酶因子组成的多酶产氢耦合体系[30]，以淀粉和水为底物，30℃条件下，采用耦合13种酶的多酶组合体把淀粉和水转化为氢气和二氧化碳，1 mol 淀粉葡萄糖和水能够生成12 mol 氢分子，新的糖氢转化技术为大规模工业产氢提供有益参考。亚利桑那大学的Bradley Moore研究组首次报道了组装Ⅱ型聚酮化学物合成酶催化的天然全合成途径，并利用此体外多酶全合成体系在单一的反应釜内把底物苯甲酸和丙二酸酯转化为天然抗生素肠道菌素，避免了复杂的菌株代谢调控，有利于工业生产放大[31]。

4 人工合成生态系统(多细胞体系)

构建具有良好协调行为的多细胞体系的人工合成生态系统，能够解决单一细胞难以高效完成的复杂功能。认识微生物之间相互作用机制，为构建人工合成生态系统提供了基础。合成生物学的一些基本器件特别是基因线路，则为相关设计提供了新工具。设计合成生态系统时，可以参考自然条件下不同细胞间的关系，例如互惠共生、拮抗、竞争等，和构成这些关系的分子基础，例如环境抑制物、细胞通信信号分子、共同底物、互补代谢物等。Frederick Balagaddé等模拟捕食-被捕食生态系统，通过合成基因线路和acyl-HSL信号联系共同培养的大肠杆菌，捕食者通过诱导捕食基因杀死被捕食者，同时被捕食者可以通过激发捕食者的解药蛋白表达援救捕食者。两种群之间存在互相依赖的关系，可通过化学物诱导使得两种大肠杆菌的数量出现波动[32]。Mark Eiteman 等构建了两种底物专一性的大肠杆菌，分别可以利用葡萄糖和木糖。通过对这两种菌的混合培养，解决了单一菌株的碳代谢抑制问题，实现对两种糖源的共同代谢，而且这种方法适用于不同浓度比例的两种糖源的体系，因此有希望实现对纤维素水解液等糖混合体系的高效利用[33]。

5 基因组编辑和组装

近些年基因组编辑技术发展很快。人们利用合成生物学的器件设计思路，基于ZF（zinc finger）、TALE（transcriptional activator-like effector）和CRISPR/Cas （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR associated proteins）系统开发了基因组编辑相关的“分子手术刀”。通过ZF、TALE、CRISPR/Cas对目标基因序列的特异性的识别作用，可以完成对基因的敲除和替换的编辑[34-37]，还可以进行基因的甲基化修饰，也可以构建人工的转录因子实现对基因表达的抑制或激活[38]。其中，CRISPR/Cas系统是近些年研究最为热门的技术，有望发展为最有前景的基因组编辑技术。

工程应用上，MAGE（multiplex automated genome engineering）较为成熟。它利用细胞的复制机理进行连续的基因组编辑[39]，能将合成的DNA片段导入基因组对基因组进行编辑。通过MAGE技术，可以对启动子[40]、核糖体结合位点（RBS）[39]进行替换从而优化合成路径。在MAGE的基础上，Geroge Church课题组开发了CAGE（conjugative assembly genome engineering）技术，可以对整个基因组进行改编，如利用CAGE将整个基因组范围内的TAG终止密码子改为TAA密码子[41]。

对于合成生物学来说，将元件DNA片段组装成为大片段是必需的步骤。近些年发展出了一些快速进行DNA组装的方法。可以分为体内组装和体外组装的方式[42]。体内DNA组装是利用细胞的重组机制，如利用酵母重组机制的DNA Assembler技术[43]及TAR（transformation-associated recombination）克隆技术，利用枯草芽孢杆菌（）重组机制的OGAB（ordered gene assembly in）技术[44]和Domino技术[45]。体内重组进行DNA组装的优点是可以进行多片段同时组装和大片段的组装。体外DNA组装技术是依赖于核酸外切酶、核酸内切酶、聚合酶、重组酶等工具酶进行体外组装的技术，如利用同尾酶的BioBrickTM克隆、利用重组酶的CPEC技术[46-47]、利用Ⅱ型内切酶的Golden Gate技术[48-49]和BglBricks技术，以及同时利用核酸外切酶、聚合酶和重组酶的Gibson Assembly技术[50-52]等。

合成基因组是合成生物学近年来的重要研究进展之一，为未来利用合成生物学设计部分或者全新生命体提供技术支撑。其中最具代表性的是美国Craig Venter研究组的工作。2003年，他们成功地合成了ΦX174噬菌体基因组[53]，拉开了人工合成噬菌体基因组的序幕。2008年，他们又成功地使用寡核苷酸合成了蕈状支原体（）全基因组[54]。为了进一步研究人工基因组的生物活性，在2010年，Craig Venter等将人工合成的蕈状支原体基因组导入山羊支原体（）细胞中，发现含人工基因组的山羊支原体细胞不仅能存活，而且经历一定生长周期后，从山羊支原体细胞中可以产生与蕈状支原体非常相似的个体[55]。该工作成功地证明了人工基因组的生物活性，也证明了通过合成生物学能够实现基因组的人工进化。

2014，由美、英、法等多国研究人员组成的科研小组在《科学》杂志上发文宣布，他们历时7 年成功构造了源于酿酒酵母的synⅢ的染色体。研究小组对这条人工合成的酵母染色体进行了500多处修改，使其简化、稳定并便于外源基因的插入[56]。这将有助于更快地培育新的酵母合成菌株，用于制造稀有药物，以及高效生产生物燃料等诸多方面。这是人类首次合成真核生物的完整染色体，是向合成人造微生物等生命体迈出的重要一步。

近年来，探究细胞维持正常生存所需最小基因组的工作相继被报道。通过基因组简化有助于理解基因组的功能，降低细胞代谢调节网络的冗余程度、提高外源基因的稳定性、优化细胞代谢途径提高对细胞的物质和能量利用率。Hiroshi Mizoguchi等通过对大肠杆菌进行多个基因组合敲除实验，得到基因组减少22%的MGF-01菌株，MGF-01与野生株相比对数期有相同的生长速率，但稳定期最终菌体浓度可达到野生型的1.5倍，而且可以使菌株的苏氨酸生产能力提高1倍[57]。Takuya Morimoto等通过删除枯草杆菌基因组的非必需片段，得到删减了20.7%的简化菌株MGB874，该菌株有更高的纤维素酶和蛋白酶生产量[58]。

6 合成生物学与化学工程

如果把中华文明的5000年历史看作一天的话（24 h），那么以合成氨（1902年）为标志的现代物质文明阶段仅为34 min，以基因工程（1973年）为标志的现代生物技术文明阶段仅为12 min。或者说，人们熟悉的现代文明才刚刚开始，合成生物学的未来有无限的可能性。在未来的50～100年内，合成生物学将对人类的医疗、化学品制造（含药品）、军事产生渐进性的、渗透性的但颠覆性的意义。如，未来合成生物学的产业应用有望与合成化学的历史贡献相媲美。值得关注的是，杜邦公司作为最大的化学品公司之一，已经转向生物化学品。

然而，合成生物学发展也存在一些深层问题。首先，目前基因线路的模块设计大多局限于简单的、演示性的人工器件，这种IT模式的模块有其局限性，未来其主流应用可能在医学领域。相反，人们对宿主的自然模块和网络的定量认识还不足，还无法真正基于定量模型进行人工生命体系的设计。未来只有更多地使用物理和数学的方法加深对这些自然模块、网络和系统的认识，才能实现理性设计。另外，由于跨物种的元器件标准化难以实现，目前需要更多地关注同物种的标准化器件。化学工程学科的发展，对合成生物学有重要启示。化学工程经历了75年的发展历史才成为一门成熟的学科。如图3所示，1887年以化学学科为基础，英国人George Davis提出了化学工程的概念，1905年麻省理工学院的William Walker教授，结合机械工程，提出了单元操作，1960年威斯康辛大学麦迪逊分校的Byron Bird教授，利用物理和数学的方法，发展了传递原理，对化学工程过程进行了分子水平的分析和表述，至此，化学工程发展成为一门成熟的基础工程学科，并形成了世界最重要的制造业之一。合成生物学可以借鉴和学习化学工程的发展过程，以生物学科为基础，整合数学、物理、化学等学科，然后逐步发展为成熟的“合成生物学”学科和工程产业。这里面，化学工程师将有重要的机会。事实上，目前合成生物学的一个重要分支，即化学品合成，基本是由欧美的化学工程系研究人员完成的。

[1]Huang G T. 10 emerging technologies that will change your world [J]., 2004, 107(1): 32-50.

[2]Singh V. Recent advancements in synthetic biology: current status and challenges [J]., 2014, 535(1): 1-11.

[3]Purnick P E M, Weiss R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems [J]., 2009, 10(6): 410-422.

[4]Miksch G, Bettenworth F, Friehs K, Flaschel E, Saalbach A, Nattkemper T W. A rapid reporter system using GFP as a reporter protein for identification and screening of synthetic stationary-phase promoters in[J]., 2006, 70(2): 229-236.

[5]Miksch G, Bettenworth F, Friehs K, Flaschel E, Saalbach A, Twellmann T, Nattkemper T W. Libraries of synthetic stationary-phase and stress promoters as a tool for fine-tuning of expression of recombinant proteins in[J]., 2005, 120(1): 25-37.

[6]Chen Y J, Liu P, Nielsen A A K, Brophy J A N, Clancy K, Peterson T, Voigt C A. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints [J]., 2013, 10(7): 659-664.

[7]Levin-Karp A, Barenholz U, Bareia T, Dayagi M, Zelcbuch L, Antonovsky N, Noor E, Milo R. Quantifying translational coupling insynthetic operons using RBS modulation and fluorescent reporters [J]., 2013, 2(6): 327-336.

[8]Wittmann A, Suess B. Engineered riboswitches: expanding researchers’ toolbox with synthetic RNA regulators [J]., 2012, 586(15): 2076-2083.

[9]Gardner T S, Cantor C R, Collins J J. Construction of a genetic toggle switch in[J]., 2000, 403(6767): 339-342.

[10]Levskaya A, Chevalier A A, Tabor J J, Simpson Z B, Lavery L A, Levy M, Davidson E A, Scouras A, Ellington A D, Marcotte E M, Voigt C A. Synthetic biology: engineeringto see light [J]., 2005, 438(7067): 441-442.

[11]Elowitz M B, Leibler S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators [J]., 2000, 403(6767): 335-338.

[12]Nistala G J, Wu K, Rao C V, Bhalerao K D. A modular positive feedback-based gene amplifier [J]., 2010, 4: 4.

[13]Wang B J, Kitney R I, Joly N, Buck M. Engineering modular and orthogonal genetic logic gates for robust digital-like synthetic biology [J]., 2011, 2: 508.

[14]Ikeda R A, Richardson C C. Interactions of a proteolytically nicked RNA-polymerase of bacteriophage-T7 with its promoter [J]., 1987, 262(8): 3800-3808.

[15]Segall-Shapiro T H, Meyer A J, Ellington A D, Sontag E D, Voigt C A. A ‘resource allocator’ for transcription based on a highly fragmented T7 RNA polymerase [J]., 2014, 10: 742.

[16]Shis D L, Bennett M R. Synthetic biology: the many facets of T7 RNA polymerase [J]., 2014, 10(7): 745.

[17]Friedland A E, Lu T K, Wang X, Shi D, Church G, Collins J J. Synthetic gene networks that count [J]., 2009, 324(5931): 1199-1202.

[18]Daniel R, Rubens J R, Sarpeshkar R, Lu T K. Synthetic analog computation in living cells [J]., 2013, 497(7451): 619-623.

[19]Li F, Hinderberger J, Seedorf H, Zhang J, Buckel W, Thauer R K. Coupled ferredoxin and crotonyl coenzyme a (CoA) reduction with NADH catalyzed by the butyryl-CoA dehydrogenase/Etf complex from[J]., 2008, 190(3): 843-850.

[20]Lan E I, Liao J C. Microbial synthesis of-butanol, isobutanol, and other higher alcohols from diverse resources [J]., 2013, 135: 339-349.

[21]Atsumi S, Hanai T, Liao J C. Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels [J]., 2008, 451(7174): 86-89.

[22]Baez A, Cho K M, Liao J C. High-flux isobutanol production using engineered: a bioreactor study withproduct removal [J]., 2011, 90(5): 1681-1690.

[23]Martin V J J, Pitera D J, Withers S T, Newman J D, Keasling J D. Engineering a mevalonate pathway infor production of terpenoids [J]., 2003, 21(7): 796-802.

[24]Ro D K, Paradise E M, Ouellet M, Fisher K J, Newman K L, Ndungu J M, Ho K A, Eachus R A, Ham T S, Kirby J, Chang M C Y, Withers S T, Shiba Y, Sarpong R, Keasling J D. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast [J]., 2006, 440(7086): 940-943.

[25]Pfleger B F, Pitera D J, D Smolke C, Keasling J D. Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes [J]., 2006, 24(8): 1027-1032.

[26]Paddon C J, Westfall P J, Pitera D J, Benjamin K, Fisher K, Mcphee D, Leavell M D, Tai A, Main A, Eng D, Polichuk D R, Teoh K H, Reed D W, Treynor T, Lenihan J, Fleck M, Bajad S, Dang G, Dengrove D, Diola D, Dorin G, Ellens K W, Fickes S, Galazzo J, Gaucher S P, Geistlinger T, Henry R, Hepp M, Horning T, Iqbal T, Jiang H, Kizer L, Lieu B, Melis D, Moss N, Regentin R, Secrest S, Tsuruta H, Vazquez R, Westblade L F, Xu L, Yu M, Zhang Y, Zhao L, Lievense J, Covello P S, Keasling J D, Reiling K K, Renninger N S, Newman J D. High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin [J]., 2013, 496(7446): 528-532.

[27]Dueber J E, Wu G C, Malmirchegini G R, Moon T S, Petzold C J, Ullal A V, Prather K L J, Keasling J D. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux [J]., 2009, 27(8): 753-759.

[28]Ajikumar P K, Xiao W H, Tyo K E, Wang Y, Simeon F, Leonard E, Mucha O, Phon T H, Pfeifer B, Stephanopoulos G. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in[J]., 2010, 330(6000): 70-74.

[29]Zhang Y H P. Production of biocommodities and bioelectricity by cell-free synthetic enzymatic pathway biotransformations: challenges and opportunities [J]., 2010, 105(4): 663-677.

[30]Zhang Y H P, Evans B R, Mielenz J R, Hopkins R C, Adams M W W. High-yield hydrogen production from starch and water by a synthetic enzymatic pathway [J]., 2007, 2(5): e456.

[31]Cheng Q, Xiang L, Izumikawa M, Meluzzi D, Moore B S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides [J]., 2007, 3(9): 557-558.

[32]Balagaddé F K, Song H, Ozaki J, Collins C H, Barnet M, Arnold F H, Quake S R, You L C. A syntheticpredator-prey ecosystem [J]., 2008, 4(1): 187.

[33]Eiteman M A, Lee S A, Altman E. A co-fermentation strategy to consume sugar mixtures effectively [J]., 2008, 2: 3.

[34]Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria [J]., 2012, 109(39): E2579-E2586.

[35]Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna J A, Charpentier E. A programmable dual-RNA—guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity [J]., 2012, 337(6096): 816-821.

[36]Ran F A, Hsu P D, Wright J, Agarwala V, Scott D A, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system [J]., 2013, 8(11): 2281-2308.

[37]Boch J, Scholze H, Schornack S, Landgraf A, Hahn S, Kay S, Lahaye T, Nickstadt A, Bonas U. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-Type Ⅲ effectors [J]., 2009, 326(5959): 1509-1512.

[38]Mali P, Aach J, Stranges P B, Esvelt K M, Moosburner M, Kosuri S, Yang L, Church G M. Cas9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering [J]., 2013, 31(9): 833-838.

[39]Wang H H, Isaacs F J, Carr P A, Sun Z Z, Xu G, Forest C R, Church G M. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution [J]., 2009, 460(7257): 894-898.

[40]Wang H H, Kim H, Cong L, Jeong J, Bang D, Church G M. Genome-scale promoter engineering by coselection MAGE [J]., 2012, 9(6): 591-593.

[41]Isaacs F J, Carr P A, Wang H H, Lajoie M J, Sterling B, Kraal L, Tolonen A C, Gianoulis T A, Goodman D B, Reppas N B. Precise manipulation of chromosomes in vivo enables genome-wide codon replacement [J]., 2011, 333(6040): 348-353.

[42]Ellis T, Adie T, Baldwin G S. DNA assembly for synthetic biology: from parts to pathways and beyond [J]., 2011, 3(2): 109-118.

[43]Shao Z, Zhao H, Zhao H. DNA assembler, angenetic method for rapid construction of biochemical pathways [J]., 2009, 37(2): e16.

[44]Tsuge K, Matsui K, Itaya M. One step assembly of multiple DNA fragments with a designed order and orientation inplasmid [J]., 2003, 31(21): e133.

[45]Itaya M, Fujita K, Kuroki A, Tsuge K. Bottom-up genome assembly using thegenome vector [J]., 2008, 5(1): 41-43.

[46]Bryksin A V, Matsumura I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids [J]., 2010, 48(6): 463-465.

[47]Quan J, Tian J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways [J]., 2009, 4(7): e6441.

[48]Agmon N, Mitchell L A, Cai Y, Ikushima S, Chuang J, Zheng A, Choi W-J, Martin J A, Caravelli K, Stracquadanio G, Boeke J D. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly oftranscription units [J]., 2015: Article ASAP.

[49]Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability [J]., 2008, 3(11): e3647.

[50]Gibson D G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments [J]., 2011, 498: 349-361.

[51]Gibson D G, Smith H O, Hutchison C A Ⅲ, Venter J C, Merryman C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome [J]., 2010, 7(11): 901-903.

[52]Gibson D G, Young L, Chuang R Y, Venter J C, Hutchison C A Ⅲ, Smith H O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases [J]., 2009, 6(5): 343-345.

[53]Smith H O, Hutchison C A, Pfannkoch C, Venter J C. Generating a synthetic genome by whole genome assembly:FX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides [J]., 2003, 100(26): 15440-15445.

[54]Gibson D G, Benders G A, Andrews-Pfannkoch C, Denisova E A, Baden-Tillson H, Zaveri J, Stockwell T B, Brownley A, Thomas D W, Algire M A, Merryman C, Young L, Noskov V N, Glass J I, Venter J C, Hutchison C A, Smith H O. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of agenome [J]., 2008, 319(5867): 1215-1220.

[55]Gibson D G, Glass J I, Lartigue C, Noskov V N, Chuang R Y, Algire M A, Benders G A, Montague M G, Ma L, Moodie M M, Merryman C, Vashee S, Krishnakumar R, Assad-Garcia N, Andrews-Pfannkoch C, Denisova E A, Young L, Qi Z Q, Segall-Shapiro T H, Calvey C H, Parmar P P, Hutchison C A, Smith H O, Venter J C. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome [J]., 2010, 329(5987): 52-56.

[56]Annaluru N, Muller H, Mitchell L A, Ramalingam S, Stracquadanio G, Richardson S M, Dymond J S, Kuang Z, Scheifele L Z, Cooper E M, Cai Y Z, Zeller K, Agmon N, Han J S, Hadjithomas M, Tullman J, Caravelli K, Cirelli K, Guo Z Y, London V, Yeluru A, Murugan S, Kandavelou K, Agier N, Fischer G, Yang K, Martin J A, Bilgel M, Bohutski P, Boulier K M, Capaldo B J, Chang J, Charoen K, Choi W J, Deng P, Dicarlo J E, Doong J, Dunn J, Feinberg J I, Fernandez C, Floria C E, Gladowski D, Hadidi P, Ishizuka I, Jabbari J, Lau C Y L, Lee P A, Li S, Lin D, Linder M E, Ling J, Liu J, Liu J, London M, Ma H, Mao J, Mcdade J E, Mcmillan A, Moore A M, Oh W C, Ouyang Y, Patel R, Paul M, Paulsen L C, Qiu J, Rhee A, Rubashkin M G, Soh I Y, Sotuyo N E, Srinivas V, Suarez A, Wong A, Wong R, Xie W R, Xu Y J, Yu A T, Koszul R, Bader J S, Boeke J D, Chandrasegaran S. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome [J]., 2014, 344(6179): 55-58.

[57]Mizoguchi H, Mori H, Fujio T.minimum genome factory [J]., 2007, 46(3): 157-167.

[58]Morimoto T, Kadoya R, Endo K, Tohata M, Sawada K, Liu S, Ozawa T, Kodama T, Kakeshita H, Kageyama Y, Manabe K, Kanaya S, Ara K, Ozaki K, Ogasawara N. Enhanced recombinant protein productivity by genome reduction in[J]., 2008, 15(2): 73-81.

Recent advances in synthetic biology

LIN Zhanglin，ZHANG Yan，WANG Xu，LIU Peng

Department of Chemical EngineeringTsinghua UniversityBeijingChina

Synthetic biology is the engineering design and construction of standardized parts, devices and modules to modify the natural life systems or thesynthesis of new life systems. Synthetic biology has been widely applied to the fields of chemical synthesis (including materials, biofuels and natural compounds), medical industry, agriculture and environmental protection. Biological parts are used to construct synthetic modules such as toggle switch, synthetic oscillator, genetic amplifier, biologic gates and cellular counter. These synthetic modules reprogram life systems to perform specific functions. Modularized metabolic pathways are optimized in the cellular chassis to realize the biological production of bulk and fine chemicals, such as butanol, isobutanol, artemisinin, and taxol. In recent years, researchers have also developed several genome-editing and DNA assembly techniques, making it possible to perform the precise editing and synthesis of genomes. Moreover, genomes of bacteriophage,andhave also been successfully synthesized. In the next 50—100 years, synthetic biology will have significant influence on medical industry, chemical (including drugs) synthesis and military affairs. Synthetic biology will have a gradual but disruptive meaning to the world.

synthetic biology；biochemical engineering；metablism; parts and devices；modules；genetic circuit；chemical synthesis；genome

2015-05-21.

Prof. LIN Zhanglin, zhanglinlin@mail.tsinghua. edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157. 20150648

Q 81

A

0438—1157（2015）08—2863—09

林章凛（1967—），男，教授。

国家重点基础研究发展计划项目（2013CB733900）。

2015-05-21收到初稿，2015-05-28收到修改稿。

supported by the National Basic Research Program of China (2013CB733900).