敲低膜联蛋白A7对胃癌细胞MGC-803增殖的影响*

吴雪艳，田焕娜，王小杰（承德医学院，河北承德 067000）

敲低膜联蛋白A7对胃癌细胞MGC-803增殖的影响*

吴雪艳，田焕娜△，王小杰
（承德医学院，河北承德 067000）

目的：应用RNA干扰技术，靶向敲低人胃癌MGC-803细胞膜联蛋白A7（Annexin A7，ANXA7）的表达，观察ANXA7低表达对MGC-803细胞增殖的影响。方法：实验分为3组，以靶向ANXA7的siRNA转染MGC-803细胞为siRNA干扰组，另设阴性对照组和空白对照组，以Western blot法检测转染后MGC-803细胞ANXA7的表达，应用MTT法、克隆形成实验检测ANXA7低表达对MGC-803细胞的增殖能力的影响。结果：siRNA干扰组细胞ANXA7的表达较阴性对照组和空白对照组明显降低（P＜0.05）。敲低ANXA7表达后，MGC-803细胞的增殖活性和克隆形成能力明显降低（P＜0.05）。结论：ANXA7低表达可抑制胃癌MGC-803细胞的增殖。

ANXA7；MGC-803；增殖

膜联蛋白A7（Annexin A7，ANXA7）是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白家族成员［1］。在生物学特性上，ANXA7参与细胞的多项生物学行为，包括细胞的生长、分化、增殖、运动、分泌、凋亡等环节［2］。多种肿瘤组织ANXA7的表达发生了改变，其表达异常与多种肿瘤的发生发展相关［3-4］。胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤，研究发现，ANXA7表达与胃癌的发生、分化程度、淋巴结转移及临床分期有关［5］。因此，ANXA7有望成为胃癌分化、转移的判断指标，有必要对其功能进行深入研究。本研究采用RNA干扰技术敲低胃癌细胞株MGC-803细胞ANXA7的表达，观察ANXA7低表达对胃癌细胞增殖能力的影响，探讨ANXA7成为胃癌治疗潜在分子靶点的可能性。

1 材料与方法

1.1 材 料 MGC-803细 胞，上海中科院 细 胞库。β-actin鼠抗单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；ANXA7鼠抗单克隆抗体、DMEM培养基、胎牛血清、siRNA试剂、脂质体LipofectamineTM2000，美国Invitrogen公司。

1.2 细胞培养及实验分组 胃癌MGC-803细胞于含10%胎牛血清的DMEM中，5% CO2、37℃培养箱中常规培养。转染前一天将细胞种植于6孔板中，使细胞在24h内达到40%-60%的密度；按照脂质体LipofectamineTM2000试剂说明书进行转染。转染后6h更换含血清培养基。其中转染靶向ANXA7 siRNA的细胞为siRNA干扰组、转染阴性siRNA的细胞为阴性对照组，空白对照组不做处理。

1.3 Western blot 检测ANXA7的表达 细胞转染48h后，用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；Western blot法检测ANXA7的表达，一抗为ANXA7鼠抗人单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，ECL检测。以检测相应细胞β-actin的表达作为内参照。应用Quantity One V4.52软件进行分析，以目的蛋白条带与内参蛋白条带的灰度比值作为ANXA7蛋白的相对表达水平。

1.4 MTT实验 细胞转染后48h消化细胞，按2000细胞/每孔接种于96孔板，分别检测24h、48h、72h和96h细胞的增殖活性。每孔加入10☒l MTT，37℃孵育4h，弃孔内培养液后，加入150☒l DMSO溶解结晶物，将培养板置于微孔板振荡器上震荡10min，酶联免疫检测仪在波长490nm处

2 结果

2.1 Western blot检测siRNA沉默ANXN7的效果 转染后48h，Western blot检测结果显示，与阴性对照组和空白对照组相比，siRNA干扰组细胞ANXN7蛋白的表达明显下降（图1）。结果显示siRNA能有效敲低MGC-803细胞ANXA7的表达。检测OD值，每次设6个重复孔。

1.5 细胞克隆形成实验 胰酶消化处于对数期生长的各组细胞，分别接种于6孔板中（500个细胞/孔），加入2ml DMEM培养液，置于5% CO2、37℃培养箱培养；培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养；弃去培养液，PBS小心浸洗2次，4%多聚甲醛固定30min，姬姆萨染液染色10min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥；肉眼计数细胞克隆数并进行分析；每组细胞设3个平行对照孔。

图1 Western blot检测MGC-803细胞ANXA7的表达

2.2 ANXA7低表达对MGC-803细胞增殖的影响 MTT法检测结果见图2。与阴性对照组和空白对照组相比，siRNA干扰组MGC-803细胞的增殖活性明显降低（P ＜0.05），阴性对照组和空白对照组MGC-803细胞增殖活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 ANXA7低表达对MGC-803细胞增殖的影响

2.3 ANXA7低表达对MGC-803细胞克隆形成的影响

siRNA干扰组细胞克隆数为（190±14），阴性对照组细胞克隆数为（370±18），空白对照组细胞克隆数为（352±23）。与阴性对照组和空白对照组比较，siRNA干扰组细胞克隆数明显降低（P＜0.05）。提示，ANXA7低表达的MGC-803细胞克隆形成能力下降。

3 讨论

胃癌是全球第二大恶性肿瘤，发病率仅次于肺癌，世界范围内5年死亡率超过80%。据国际癌症研究中心分析统计，全球每年有近100万胃癌新发病例，有明显的流行病学特征和地理差异，而我国为高发地区。在临床上，即使是根治性切除术，胃癌5年内复发率仍高达60%-70%，转移复发已成为提高胃癌患者生存率的主要障碍［6］。目前，已发现许多与胃癌发生发展密切相关的基因，其中ANXA7与胃癌关系密切［5］。

ANXA7是膜联蛋白家族成员，该家族具有典型的磷脂结合特性、Ca2+通道形成特性，在膜转运、细胞分化、凋亡、生长调节及钙离子信号途径等方面发挥广泛的生物学功能。并且，ANXA7能够促进膜的聚集、黏着、融合、运输、信号转导等过程。

研究显示，ANXA7是原癌基因Ras调节通路的组成部分，ANXA7低表达可抑制肝癌细胞的增殖能力［7-8］。本研究观察了siRNA干扰ANXA7表达后对胃癌MGC-803细胞增殖能力的影响，结果发现siRNA干扰组MGC-803细胞的增殖能力和克隆形成能力均明显降低。本研究结果表明，ANXA7低表达能够降低MGC-803细胞的增殖能力，但具体机制有待于进一步研究。

［1］Creutz CE， Pazoles CJ， Pollard HB. Identif ication and purif ication of an adrenal medullary protein （synexin） that causes calciumdependent aggregation of isolated chromaff in granules［J］. J Biol Chem， 1978， 253（8）： 2858-2866.

［2］Jia L， Wang S， Cao J， et al. siRNA targeted against matrix metalloproteinase 11 inhibits the metastatic capability of murine hepatocarcinoma cell Hca-Fto lymph nodes［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2007， 39 （11）： 2049-2062.

［3］Srivastava M， Bubendorf L， Raffeld M， et al. Prognostic impact of ANX7-GTPase in metastatic and HER2-negative breast cancer patients［J］. Clin Cancer Res， 2004， 10（7）： 2344-2350.

［4］Yadav AK， Renfrow JJ， Scholtens DM， et al. Monosomy of chromosome 10 associated with dysregulation of epidermal growth factor signaling in glioblastomas［J］. JAMA， 2009， 302（3）：276-289.

［5］奚剑敏，赵强.AnnexinA7表达与胃癌分化和转移关系研究［J］.临床和实验医学杂志，2010，9（10）：726-727.

［6］Takeuchi H， Ueda M， Oyama T， et al. Molecular diagnosis and translymphatic chemotherapy targeting sentinel lymph nodes of patients with early gastrointestinal cancers［J］. Digestion， 2010，82（3）： 187-191.

［7］Ji H， Moritz RL， Kim YS， et al. Analysis of Ras-induced oncogenic transformation of NIH-3T3 cells using differentialdisplay 2-DE proteomics［J］. Electrophoresis， 2007， 28（12）：1997-2008.

［8］Huang Y， Wang Q， Du Y， et al. Inhibition of annexin A7 gene and protein induces the apotosis and decreases the invasion， migration of the hepatocarcinoma cell line［J］. Biomed Pharmacother， 2014，68（7）： 819-824.

EFFECTS OF AXNXA7 KNOCKDOWN ON PROLIFERATION OF GASTRIC CARCINOMA MGC-803 CELLS

WU Xue-yan， TIAN Huan-na， WANG Xiao-jie

（Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective：To investigate low expression of Annexin A7 （ANXA7） on proliferation of gastric cancer MGC-803 cells by target-silencing ANXA7 expression using RNA interference technique.Methods：MGC-803 cells were grouped into siRNA interference group， negative control group and blank control group. RNA interference technology was used to transfect the siRNA targeted ANXA7 into MGC-803 cells to knock down expression of ANXA7. Western blot was used to detect the expression of ANXA7 after transfection； MMT assay and clone formation assay to detect the effects of low expression of ANXA7 on proliferation of MGC-803 cells. Results：The expression of ANXA7 in MGC-803 cells of siRNA interference group were obviously lower than negative control group and blank control group （P＜0.05）. The proliferationactivity and colony forming ability of MGC-803 cells declined after knocking down expression of ANXA7 （P＜0.05）. Conclusions：Low expression of ANXA7 can inhibit proliferation of gastric cancer MGC-803 cells.

Annexin A7 （ANXA7）； Gastric cancer MGC-803 cell； Proliferation

R735.2

A

1004-6879（2015）02-0095-03

2014-10-10）

*河北省高校省级重点学科“病理生理学”建设项目资助