2型糖尿病大鼠肝脏肝细胞核因子-4α表达的变化*

刘东慧，侯丽娜，乔志燕，陈志宏△

（1.承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

2型糖尿病大鼠肝脏肝细胞核因子-4α表达的变化*

刘东慧1，侯丽娜1，乔志燕2，陈志宏1△

（1.承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

目的：探讨2型糖尿病大鼠肝脏肝细胞核因子-4α（HNF-4α）表达的变化和意义。方法：24只雄性SD大鼠随机分为正常对照组和糖尿病模型组，每组12只大鼠。链脲佐菌素连续腹腔注射法制作2型糖尿病大鼠模型。采用SP免疫组织化学染色、Western Blotting法、RT-PCR法检测大鼠肝脏HNF-4α的表达情况。结果：与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠肝脏HNF-4α蛋白和mRNA的表达均明显升高（P＜0.01）。结论：肝脏HNF-4α表达的升高可能参与了2型糖尿病时肝脏损伤的发生发展。

2型糖尿病；肝脏；肝细胞核因子-4α（HNF-4α）

糖尿病肝病是指由糖尿病引起的肝脏组织学变化以及功能变化的病变，包括肝硬化、脂肪肝和肝炎等，其中以非酒精性脂肪性肝病最为常见［1］。临床上糖尿病导致的肝脏病变，引起肝纤维化、肝硬化并不少见，使患者血糖水平发生剧烈波动：空腹低血糖、餐后高血糖，胰岛素反复调整用量也不易控制，低血糖昏迷和糖尿病酮症酸中毒的发生率升高，甚至出现生命危险［2-3］。因此，重视糖尿病患者肝脏并发症的防治和肝功能的保护，对减少糖尿病患者的并发症提高患者生活质量具有积极意义。为深入研究糖尿病时肝脏损伤的发生机制，本研究采用免疫组化染色、Western Blotting法和RT-PCR法检测了2型糖尿病模型大鼠肝脏肝细胞核因子-4α（HNF-4α）表达的变化，以期为糖尿病并发症的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和处理 清洁级雄性SD大鼠，合格证号712024，体质量200-250g，购自河北医科大学实验动物学部。24只大鼠随机分为以下2组：①正常对照组，12只，大鼠常规饲养，不做处理。②糖尿病模型组，12只，建立2型糖尿病大鼠模型。建立模型的方法：2%链脲佐菌素（25mg/ kg）每天一次连续腹腔注射3d，注射链脲佐菌素后7d以空腹血糖≥16.7mmol/L作为模型成功建立的标准。

1.2 实验材料 链脲佐菌素，美国Sigma公司；HNF-4α兔抗大鼠多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；SP免疫组化试剂盒、DAB显色液，武汉博士德生物工程有限公司；小鼠抗β-actin单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；Trizol，美国Invitrogen公司；HNF-4α引物，上海生工生物工程有限公司；RT-PCR试剂盒，北京天根生化科技有限公司。

1.3 取材及检测血糖水平 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经内眦于眶后静脉丛采血，离心取血清，采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。大鼠取血后处死，取肝脏，部分入Bouins液固定，部分入液氮速冻后移入-80℃冰箱保存。

1.4 肝脏HNF-4α蛋白表达的检测

1.4.1 免疫组织化学染色及定量分析：Bouins液固定肝脏常规石蜡包埋，5μm厚连续切片。采用SP免疫组化法，HNF-4α一抗1：100稀释，阴性对照为PBS代替一抗，以细胞核出现棕黄色颗粒至棕褐色颗粒为阳性细胞标志。每组随机选取12张切片，每张切片在10×40倍显微镜下选取肝脏视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对HNF-4α阳性产物的IOD值进行定量分析。

1.4.2 Western Blotting法：取30mg液氮中保存的肝脏组织匀浆提取蛋白，蛋白浓度的确定使用二喹林甲酸蛋白试剂盒，8%积层胶和14%分离胶电泳，HNF-4α蛋白上样量60μg，4℃、2mA/cm2转膜2h，5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗（HNF-4α 1：100，β-actin 1：1 000）室温孵育2h，二抗（1：5000）1h，Super ECL Plus超敏发光液显影。胶片扫描后，采用Quantity One 4.6.2软件对显影条带进行分析，计算目的条带与β-actin条带的灰度比值，作为HNF-4α蛋白的相对表达水平。

1.5 肝脏HNF-4α mRNA表达的检测 取100mg液氮保存肝脏组织，提取总RNA。取3μg总RNA为模板反转录成cDNA，反应条件为：42℃孵育3min；加入反应液Mix，42℃孵育15min；99℃反应3min。PCR反应条件：94℃，2min；94℃，30s；59℃，30s；72℃，1min，第2步起循环。PCR引物序列及扩增条件见表1。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用ZF型紫外透射反射分析仪摄片，并用Quantity One 4.6.2软件进行定量分析，以HNF-4α条带吸光度与β-actin条带吸光度的比值，作为HNF-4α mRNA的相对表达水平。

表1 PCR引物序列及扩增条件

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计处理，行t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠的血糖水平 与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠的血糖水平明显升高（P＜0.01）。见表2：

表2 各组大鼠的血糖水平和肝脏HNF-4α的表达（±s，n=12）

表2 各组大鼠的血糖水平和肝脏HNF-4α的表达（±s，n=12）

与糖尿病模型组比较：*P＜0.01

组别 　　血糖（mmol/L） 肝脏HNF-4α蛋白表达肝脏HNF-4α mRNA表达免疫组化法 　Western Blotting法正常对照组 　10.83±2.03*　9436.679±292.681*　0.025±0.002*　0.499±0.036*糖尿病模型组 　29.45±4.82 　37822.262±331.429 　0.043±0.002 　0.903±0.012

2.2 各组大鼠肝脏HNF-4α的表达 免疫组化结果显示，HNF-4α免疫阳性产物为棕褐色，位于肝细胞的细胞核。免疫组化染色法、Western Blotting法、RT-PCR法定量分析结果见表2：与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠肝脏HNF-4α蛋白和mRNA的表达均明显升高（P＜0.01）。

3 讨论

肝细胞核因子-4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF-4α）在肝脏高度表达，是核受体超家族配基激活型转录因子的高度保守成员之一，属孤受体范畴［3］；HNF-4α具有脂溶性激素受体的特性，能够直接进入胞核调节肝脏、胰岛代谢相关基因的表达［4］。国内外大量的研究证明，HNF-4α与2型糖尿病之间存在密切的关联，并与胰岛素抵抗有一定关系：1.HNF-4α可调节肝脏内糖异生途径中限速酶之一的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因特异性表达，并可直接调节肝脏糖异生的效率［5-6］。2.HNF-4α是葡萄糖转运蛋白2、醛缩酶B、丙酮酸激酶基因表达所必需的，对葡萄糖摄取、肝糖异生及糖酵解途径有重要意义［7］。3.HNF-4α可能通过刺激胰岛素合成及释放、抑制肝糖原异生、促进葡萄糖摄取以及促进糖酵解等作用参与血糖调节［8］。

本研究发现，链脲佐菌素致2型糖尿病大鼠模型肝脏HNF-4α蛋白的表达水平明显升高，与Oyadomari等的研究结果一致［9］。因此提示，HNF-4α可能参与了2型糖尿病肝脏损伤的发生发展。

［1］Matafome P， Louro T， Rodrigues L， et al. Metformin and atorvastatin combination further protect the liver in type 2 diabetes with hyperlipidaemia［J］. Diabetes Metab Res Rev， 2011， 27（1）：54-62.

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［3］宋景春，李志超.肝细胞核因子-4与MODY［J］.国外医学-内分泌学分册，2001，1（21）：13-15.

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［5］Hayhurst GP， Lee YH， Lambert G， et al. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha （nuclear receptor 2A1） is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis［J］. Mol Cell Biol， 2001， 21（4）： 1393-1403.

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［9］Oyadomari S， Matsuno F， Chowdhury S， et al. The gene for hepatocyte nuclear factor（HNF）-4alpha is activated by glucocorticoids and glucagon， and repressed by insulin in rat liver［J］. FEBS Lett， 2000， 478（1-2）： 141-146.

CHANGES OF HEPATOCYTE NUCLEAR FACTOR 4 ALPHA EXPRESSION IN LIVER OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS RATS

LIU Dong-hui， HOU Li-na， QIAO Zhi-yan， et al

（Department of Human Anatomy， Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective：To investigate changes and signifi cance of hepatocyte nuclear factor 4 alpha （HNF-4α） in liver of type 2 diabetes mellitus rats model.Methods：24 male SD rats were randomly divided into normal control group and diabetes model group with 12 rats in each group. The type 2diabetes model rats were induced by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin. SP immunohistochemical stain， Western Blotting and RT-PCR were used to detect HNF-4α expression in liver. Results： Compared with rats in normal control group， the HNF-4α protein and mRNA expression in liver of rats in diabetes model group increased obviously （P＜0.01）. Conclusions： High expression of HNF-4α may participate development of liver injury during diabetes mellitus.

Type 2 diabetes mellitus； Liver； Hepatocyte nuclear factor 4 alpha （HNF-4α）

R587.1

A

1004-6879（2015）02-0100-03

2014-09-03）

* 国家自然科学基金项目（81441133），河北省自然科学基金项目（H2013406096），河北省高校重点发展学科“人体解剖与组织胚胎学”建设项目资助