复方青黛膏对寻常型银屑病皮损内 VEGF的影响

赵文杰，陈丽红

（福建中医药大学附属厦门中医院皮肤科，厦门361009）

复方青黛膏对寻常型银屑病皮损内 VEGF的影响

赵文杰，陈丽红

（福建中医药大学附属厦门中医院皮肤科，厦门361009）

目的 以银屑病皮损内血管内皮细胞生长因子（VEGF）为指标，探讨复方青黛膏对银屑病的治疗机制。方法 60例寻常型银屑病患者随机分为3组：空白对照组、他扎罗汀组、青黛膏组，疗程4周。免疫组化检测复方青黛膏治疗前后皮损内的VEGF阳性染色，并以video pro 32彩色图像分析系统测定其灰度值。Realtime-PCR法检测治疗前后mRNA的表达，并与他扎罗汀对照及空白组比较。结果 复方青黛膏组皮损内VEGF蛋白灰度值低于空白组及他扎罗汀组（P＜0.05），其VEGF mRNA表达水平较其他组低（P＜0.05）。结论 复方青黛膏可降低皮损内VEGF的表达，通过抑制局部微血管增生治疗寻常型银屑病。

复方青黛膏；寻常型银屑病；血管内皮细胞生长因子

新生血管学说在银屑病发病机制的研究中越来越被重视。银屑病最先发生的病理改变是血管的分布和形成的改变，银屑病的复发与皮损内真皮乳头的微血管内皮细胞的过度表达有关，其皮损处真皮乳头微血管扩张迂曲、通透性增高、微血管数量增多，并与VEGF的过高表达直接相关［1-2］。新生血管学说为临床上治疗银屑病提供了重要线索，他扎罗汀治疗银屑病的机制之一可能在于减少银屑病病人角质形成细胞VEGF的表达，从而改善银屑病皮损的血管扩张、增生等病理改变，进而减轻炎症细胞浸润及炎症反应［3-4］。笔者发现外用复方青黛膏可有效地减轻患者皮损红斑，肥厚及点状出血等现象，故推测，这种现象与其抑制银屑病血管新生有关。含青黛制剂的药物治疗银屑病在我国已广泛的应用，但治疗机制不明，内服青黛引起消化道出血等不良反应明显 ，临床应用受到了限制。笔者基于银屑病新生血管学说，探讨外用复方青黛膏治疗银屑病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例为我科门诊就诊的寻常型银屑病患者，确诊纳入试验后随机分为3组：不用药物治疗的空白组，他扎罗汀治疗组，复方青黛膏治疗组。复方青黛膏组成：青黛粉50 g，黄柏粉20 g，滑石粉20 g，炉甘石粉20 g。以凡士林2 000 mL为基质，100℃熔解后加入药物，调均，冷却后分装，每30 g为1个包装单位。

1.2 纳入标准 我科门诊病人，经临床及病理诊断确诊为寻常型银屑病（进展期），中医辨证属风热血燥者，年龄＞16岁，近2个月内未系统服用维A酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等药物，2周内未使用任何外用药物。中医辨证标准参考《中医病证诊断疗效标准》［5］风热血燥证：皮损鲜红，皮疹不断出现，红斑增多，刮去鳞屑可见发亮薄膜，点状出血。伴心烦口渴，大便干，尿黄。舌质红，舌苔黄或腻，脉弦滑或数。

1.3 治疗方法 根据皮损面积，从小剂量开始随病人耐受情况逐渐加量涂抹于皮损上，每日早晚各1次，每次擦涂不能大于皮肤总面积的20%，治疗期间不得应用非试验设计的其他药物，试验共进行4周，疗程前后手术取病人同一区域内典型皮损。所选择的皮损在1%利多卡因局部麻醉下手术切除，切除后的皮损块立即速冻在液氮中，应用于免疫组化的皮损块立即进行石蜡包埋。

1.4 观察指标 1）免疫组化检测皮损组织中VEGF含量。采取免疫组化二步法，试剂盒购于武汉博士德生物制品有限公司。操作参照试剂盒。VEGF表达结果判定标准：光学显微镜下细胞浆出现棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞，在video pro 32彩色图像分析系统下每张切片选取5个具有代表性的视野，在高倍镜（×200）下进行测试，测出测试区域的灰度值 ，以平均值作为该标本的阳性系数。2）Real time PCR（SYBR Green I）检测皮损内VEGF mRNA表达。RNA的提取：新鲜组织加入1 000 μL TRIzol试剂（TaKaRa，Japan），电动匀浆器充分匀浆后（5 min 1次，冰上孵育5 min，重复3次），室温孵育15 min使组织细胞充分裂解。将处理液转移到1.5 mL EP管中。加入0.2 mL氯仿剧烈震荡30 s，室温孵育15 min。4℃，12 000 rpm／min，离心15 min。转移上层水相至另一离心管，加入0.5 mL异丙醇，混匀后室温放置10 min。4℃，12 000 rpm／min，离心10 min。弃上清，加入1 mL DEPC处理75%乙醇。4℃，7 500 rpm／min，离心5 min。弃上清，室温干燥10 min，加入20 μL DEPC处理ddH2O，收集管中的溶液即为RNA溶液。使用DU-730紫外／可见分光光度计检测RNA的纯度和总量后于-80℃保存备用。cDNA合成根据逆转录试剂盒提供的方法将总RNA逆转录为cDNA分别以0.5～1 μg的总RNA为模板合成cDNA，采用TaKaRa公司提供的反转录试剂盒，采用TaKaRa公司提供SYBR ExScriptTM RT-PCR试剂盒，在ABI PRISM7000 Real-Time PCR扩增仪上进行扩增，扩增仪自动获得各基因扩增的原始Ct值，对比内参基因得到△Ct值，通过-△△Ct的计算方法得到各组的-△△Ct值，根据模板浓度制定标准，曲线，测定扩增效率E，各组的目标基因转录的相对水平表示为E-△△Ct。PCR引物设计：参考文献资料获取引物序列，由广州英骏生物工程有限公司合成。引物序列如下：VEGF-S：GGCCAACTAC AACTTCTTCC；VEGF-AS：CCATCATGGATTCGAG AAAA；Beta-actin-s：TCA TCACCATTGGCAATGAG；Beta-actin-as：CACTGTGTTGGCGTACAGGT。反应体系为20 μL，共40个循环。

1.5 统计学方法 数据分析采用SPSS 13.0软件处理，计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较经方差齐性检验后用单因素方差分析 ，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组治疗前后皮损中VEGF变化 见图1、表1。

表1 各组治疗前后皮损中VEGF变化（±s，n＝20）

表1 各组治疗前后皮损中VEGF变化（±s，n＝20）

注：与空白组比较，＃P＜0.05；与他扎罗汀组比较，△P＜0.05

治疗后空白组 182．5±14.3 172.3±16.1他扎罗汀组 187.3±13．5 58．7±4．7＃青黛膏组 179．4±14．9 21．4±3．0组 别 治疗前＃△

2.2 各组患者皮损内VEGF mRNA的表达 见图2。

3 讨论

银屑病皮损的主要病理变化是角化不全，角化过度，炎症细胞浸润，血管异常增生。其中，微血管增生与银屑病的发生、持续及复发有密切的关系［6］，血管内皮生长因子VEGF在血管生成不同过程中发挥重要作用，其特异性的作用于血管内皮细胞，促进血管生成［7］。银屑病患者皮损中VEGF呈阳性表达，正常人皮肤组织中基本无表达［8］。VEGF在银屑病发病中发挥主要作用的观点又进一步被表皮特异性过度表达VEGF转基因鼠所证实［9-10］。

图1 免疫组化检测各级VEGF，图中深色为VEGF阳性染色

图2 各组患者皮损内VEGF mRNA的表达

有学者发现青黛可抑制与角质形成细胞的过度增殖，外用青黛膏制剂可直接抑制银屑病患者皮损内增殖细胞核抗原（PNCA），青黛及其有效成分靛玉红可对角质形成细胞的增殖分化起调控作用［11］。青黛制剂作为我国长期广泛使用的抗银屑病药物，在临床上取得令人满意的疗效。1991年来陆续报道了复方青黛丸、升血小板胶囊等含青黛成分的口服药物产生消化道出血、肝功能损害等较为严重的不良反应［12］，推测消化道出血可能与青黛促凝作用导致管腔内纤维素性血栓形成，堵塞血管，从而引起肠道黏膜缺血坏死有关。至此，青黛的安全性受到了质疑。而外用青黛相关成分却未见不良反应的报道。

在既往的研究中发现，复方青黛膏外用可明显减轻皮损内的点状出血、红斑及炎性反应［13］，此次研究中笔者发现，复方青黛膏可显著降低银屑病皮损中VEGF的表达，抑制皮损内微血管增生，进而减轻皮损内的增生、角化、点状出血及炎性反应。但青黛抑制VEGF表达的机制仍需进一步探索。VEGF是最重要的血管新生的因素，但微血管增生还受到其他细胞因子的影响：如成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、血管生成素（angiopoiet-in）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、血小板衍生性生长因子（platelet derived growthfactor，PDGF）等，致炎因子及缺氧亦是血管新生的促成因素［14］。下一步将进行外用青黛制剂对微血管增生抑制作用的系统研究，并改良剂型以增加药物透皮性等。

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Natural indigo compound ointment on psoriasis vulgaris by detecting VEGF in lesions

ZHAO Wenjie，CHEN Lihong
（Department of Dermatology，Xiamen Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Xiamen 361009，China）

Objective To study the therapeutic mechanism of natural indigo compound ointment on psoriasis based on detecting vascular endothelial growth factor in lesions．Methods The 60 patients with psoriasis vulgaris are randomly divided into 3 groups：natural indigo compound ointment，tazarotene cream and control groups．The course of treatment is four weeks．The expression of VEGF in psoriatic patients'lesions is observed by immunohisto-chemical assay before and after treatment and the grey level of VEGF is analyzed by video pro 32 color image analysis system．The expression of VEGF mRNA（P＜0．05）in lesions is detected by real-time PCR before and after treatment．Results The grey level of VEGF and expression of VEGF mRNA in lesions of natural indigo compound ointment group are lower than that in the tazarotene cream and control groups（P＜0．05）．Conclusion Natural indigo compound ointment can suppress the expression of VEGF and inhibite hyperplasia in micro-vessel in the treatment of psoriasis vulgaris．

natural indigo compound ointment；psoriasis vulgaris；vascular endothelial growth factor

R275.9

A

2095-6258（2015）05-1046-03

10．13463／j．cnki．cczyy．2015．05．060

2014-10-21）

厦门市科技计划社会发展项目（3502Z20104011）。

赵文杰（1972-），男，博士，副主任医师，主要从事皮肤免疫学研究。