维生素B12 的发酵生产及应用

□宋晓伟 黄 勋

一、维生素B12 简介

维生素B12 又名钴胺素，简称VB12，为红色晶体，是自然界唯一含有金属元素的维生素，也是目前已知的分子量最大，结构最复杂的维生素。VB12 是1926 年由美国哈佛医学院Minot 和Murphy 首先发现并用于“阿的生贫血病”的治疗［1］，而Minot 等人也因此获得了1934 年诺贝尔医学奖。1948 年，英美两国科学家几乎同时从肝脏中提取得到了这种红色的晶体［2～3］，并命名为维生素B12。1955 年英国牛津大学的Hodgkin 则第一次确定了VB12 的化学结构［4］，如图1所示。中心咕啉环、中心环轴向Coβ 配基部分及1 个含有核苷酸环的Coα 配基。中心咕啉环由相连的4 个吡咯和1 个钴原子组成，钴螯合在4 个吡咯中心。1972 年美国科学家Woodward，R.B 所领导的团队，历时11 年，首次完成了VB12的全化学合成［5］。

图1 维生素B12 的化学结构

现在，全球VB12 总产能达106 吨，总需求量在44吨，国际为主要需求市场，年需求量在40 吨左右，主要应用于营养补充剂领域，国内需求在4 吨，主要应用于药物和饲料添加剂领域。氰钴胺占到市场份额的82%，衍生物10%，添加剂8%。国内市场药典版本需求量在450～500 公斤/年，添加剂在3，000～3，550 公斤/年。由于目前中国出口仍然停留在以VB12 原粉为主，低端添加剂为辅的阶段，尚无能力与国外公司(DSM)新的产品剂型竞争，需大力开拓高端市场。

二、维生素B12 的生物合成

由于维生素B12 化学结构复杂，它是自然界中生物合成途径最为复杂的小分子生物物质之一，随着科技的发展，维生素B12 的生物合成途径也已有了详细的研究和阐述。但是，因为合成步骤多，不易完成，到目前为止，还未有产业化的报道。维生素B12 主要由真细菌和部分古生菌通过生物厌氧和耗氧途径合成，生物合成过程涉及的基因有30 余个［6］。Escalante－ Semerena、Warren、Scott、Blanche、Battersby 等人通过对脱单假单胞菌属(Pseudomonas denitrificans)耗氧合成VB12 的研究，阐述了VB12 的耗氧合成途径［6～11］。而厌氧合成途径涉及菌种主要有费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)［12］、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)［13］、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)［14］。

三、发酵法生产维生素B12

由于VB12 结构复杂，化学合成过程繁琐而且成本昂贵。最初是通过从动物肝脏等组织中提取，但效率低下。后来从链霉素发酵废液中提取，但是产能级效率依旧十分有限。直到20 世纪70 年代，开始专门的微生物商业化生产，全球VB12 的产能才逐步提高。

表1 生产VB12 的各种细菌及其产率

(一)菌株。自然界中可以产VB12 的只有微生物，但不是所有微生物都可合成维生素B12，只有相当一部分原核生物可以通过生物途径合成维生素B12。可用于生产维生素B12 的菌株的产率如表1 所示［15］。应用于工业生产的菌株主要有厌氧费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(P.shermanii)及耗氧的脱单假单孢杆菌(P.denitrificans)。通过厌氧发酵生产维生素B12 的产率较低，国内各生产企业主要进行好氧发酵。当前，国内耗氧微生物发酵法生产维生素B12 的发酵水平在200～260 mg/L，好的批次发酵水平已接近300mg/L。

(二)工艺。

1.好氧发酵工艺。好氧发酵的菌株主要是脱单假单胞菌(P.denitrificans)，培养基以甜菜糖蜜、麦芽糖、蔗糖为碳源，以玉米浆及酵母膏为氮源，添加无机盐及Co，并添加5，6－ 二甲基苯并咪唑及甜菜碱作为前体。张嗣良团队对过程参数控制及发酵放大过程进行了优化［16］，在工业生产中除帝斯曼在欧洲保留了一条耗氧生产线以外，国内的华北制药集团，石药集团，玉峰药业，宁夏多维等也多采用好氧发酵生产VB12。采用120m3的标准好氧发酵罐，一般采用流加碳源的分批补料三级发酵工艺。最适发酵温度为32℃，最适PH 值为7.0 ±0.5，发酵过程流加甜菜碱及前体，并控制发酵过程发酵液中甜菜碱的含量在0.1%～1.0%，发酵周期在160h～180h。该工艺发酵水平数倍于厌氧发酵，在生产氰钴胺时有巨大优势。

2.厌氧发酵工艺。厌氧发酵工艺采用的菌种有氧费氏丙酸杆菌(P.freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(P.shermanii)。丙酸杆菌降解葡萄糖产生丙酸、乙酸的伍德－ 沃克曼反应途径中涉及到甲基丙二酰CoA 异构酶，该酶需要VB12 作为辅酶，所以丙酸杆菌中存在着生物合成VB12 的全套遗传物质及完整合成途径。

工业生产过程中，只有石药集团还保留有厌氧VB12 发酵生产线，以谢氏丙酸杆菌(P.shermanii)为生产菌株，培养基主要以葡萄糖为碳源，玉米浆为氮源，添加无机盐及Co 源，并添加前体5，6－ 二甲基苯并咪唑，最适温度控制在30℃，最适PH 用氨水控制在6.5，低速间歇搅拌，发酵周期为90h 左右。由于厌氧发酵的产物80%以上为腺苷钴胺，虽产能较低，但是在生产腺苷钴胺时有明显优势，而且产品杂质少、易分离，还可从发酵液中提取丙酸等副产品。

四、维生素B12 的应用

(一)医疗应用。维生素B12 在医疗方面的应用主要是针对VB12 缺乏症的治疗和预防。维生素B12 缺乏将导致DNA 的合成减少，有丝分裂速率降低，延迟甚至破坏正常细胞特别是骨髓细胞和粘膜细胞的分化，形成不正常的巨细胞，从而形成巨幼红细胞性贫血。因此，维生素B12 可辅助治疗巨幼红细胞性贫血、药物中毒引起的贫血、再生障碍性贫血和白细胞减少症等［17～18］。维生素B12 还有维护神经髓鞘的代谢与功能，因此维生素B12 作为一些神经方面疾病或损伤的辅助治疗药物。最近研究显示，维生素B12 的缺乏与抑郁症［19］及老年痴呆等精神疾病也有一定的联系，维生素B12 亦可用于抑郁症的辅助治疗，及老年痴呆的预防。

(二)饲料应用。维生素B12 可以促进动物对蛋白质的利用和个体的生长，特别是幼小动物。对于常见人工饲养的牲畜及禽类，只有反刍类动物自身可通过生物途径合成维生素B12。因此对于非反刍类哺乳动物，在禽类等饲料中添加维生素B12 有重要意义。对于鱼类的养殖，维生素B12 有助于鱼类抵抗水体中重金属及相关有毒成分的能力，降低鱼苗的死亡率。对于全世界来说，疯牛病事件以后也逐步使用成分明确的营养品替代原有的骨肉粉。尽管维生素B12 可用于很多方面的医学治疗，但目前世界上维生素B12 的最大消费途径，还是饲料添加剂。

(三)其他应用。除了医疗及饲料的用途VB12 还在一些工业及视屏领域用着重要用途，例如食品着色、室内环保去除甲醛、自然环境中卤素脱卤等。

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