促红细胞生成素长效化技术的研究与应用

晏丽，白义，王浛

促红细胞生成素长效化技术的研究与应用

晏丽，白义，王浛

促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是最早通过基因工程技术研制的蛋白类药物之一（1989 年由 Amgen公司研制成功并上市的重组人 EPO），二十多年来一直是基因工程药物中的常青树。由于 EPO 应用范围广、市场规模大，从而促使生物技术的革新不断应用于该品种，增强其生物学活性并延长其体内作用时间。本文将着重总结近年来 EPO药物长效化的各种理论和实践的成果，展望未来长效 EPO药物的发展趋势。

1 促红细胞生成素简介

1.1 促红细胞生成素的结构、信号通路和生物学作用

促红细胞生成素是一种主要由肾脏皮质管周围间质细胞合成并分泌（胎儿的肝脏亦可合成）的糖蛋白类激素［1］。EPO 通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化来控制红细胞的生成。成熟 EPO 的多肽部分有 165 个氨基酸残基，含四个糖基化位点，分别位于第 24、38、83 和126 个氨基酸残基的位置。前三个为 N 位糖链，最后一个为 O 位糖链［1］。其中，N-端糖链的倒数第二个糖残基为唾液酸，它可以起到避免 EPO 被肝脏代谢，保护 EPO 体内生物活性的作用［2-4］。

EPO 的受体主要分布于红系干细胞、巨核细胞干细胞、CD34+细胞、血管内皮细胞以及多种肿瘤细胞表面［5-6］。人类 EPO 受体为一 508 个氨基酸残基的跨膜蛋白，属于造血生长因子受体家族。EPO 与其受体结合后可激活与 EPO受体胞质近膜区结合的 JAK-2，使其磷酸化，而磷酸化的JAK-2 可以进一步磷酸化 STAT，启动相关基因表达［5， 7］。EPO 受体活化涉及的信号通路还包括 SHC 途径［8-9］和PI-3 激酶途径［10］。

EPO 不仅可以作用于造血单能干细胞促进未成熟红细胞的增殖和成熟，最新发现还表明 EPO 可以阻断红系干细胞从红细胞集落形成单位细胞（CFU-E）到早幼红细胞阶段的细胞凋亡，从而增加红系干细胞的数量［11-12］。EPO 还能与血小板生成素一起促进巨核细胞集落形成单位细胞（CSF-Meg）的增殖和成熟，并刺激胞质与母体分离形成血小板［13］。还有发现表明，EPO 亦可作用于 B 细胞而提高其免疫球蛋白的合成［14］。

1.2 重组人促红细胞生成素的研制与市场状况

基于 EPO的这些生物学活性，其很早就被考虑用于贫血治疗。早期 EPO 主要从尿液中提取。20世纪 80 年代，随着分子生物学技术的迅速发展，人类 EPO 基因被从人类基因库中分离并测序，继而实现了在哺乳动物细胞中的表达。1989 年，美国 Amgen 公司首先研制成功重组人红细胞生成素（rhEPO），在治疗肾性贫血方面取得了令人瞩目的成就［15］。但应用其治疗需要大剂量频繁给药，给患者的生活带来不便，并造成较大经济负担。因此，人们开始研制长效 EPO 药物。

2001 年，长效 EPO Aranesp 获 FDA 批准，2002 年初正式上市，2003 年销售额即达到 15.4 亿美元，迅速抢占了 EPO 的市场。目前国际市场上主要的长效 EPO 品种有安进的 Epogen、Aranesp 以及强生的 Procrit/Eprex/Erypo。长效 EPO 的市场前景十分广阔，仍将是占据世界血液病治疗中的主要品种。

我国自主研发的重组人 EPO 产品自 1997 年正式上市以来［16］，发展迅猛，目前国产 EPO 已基本垄断国内市场。但我国企业在长效 EPO 药物研发方面远远落后于发达国家。百泰生物药业在国家“十二五重大专项”资助下研发的高糖基化 EPO 融合蛋白（与人 IgG 的 Fc 片段融合）在临床前测试中表现出高生物活性与超长半衰期（为传统EPO 药物 5.4 倍），达到国际先进水平，未来有望成为填补国内空白的先进品种。

1.3 EPO 基因的表达和临床应用

目前，重组人 EPO 主要在哺乳细胞中表达，包括猴肾细胞（COS 细胞）、地鼠肾细胞（BHK 细胞）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO 细胞）和 Psi 细胞等［17］。研究表明，使用 EPO的基因组 DNA 在哺乳动物细胞中表达 EPO，其表达水平明显高于使用 EPO 的 cDNA 进行表达。工业生产中重组人 EPO 蛋白主要在 CHO 细胞中进行表达，其 N 端糖链有双末梢和四末梢两种形式，后者是体内生物学活性较高的形式，与天然人 EPO 相似［18］。

除肾性贫血外，重组人 EPO 药物对再生障碍性贫血（AA）、单纯红细胞再生障碍性贫血（PRCA）、慢性髓系白血病（CML）、溶血性贫血以及由造血干细胞移植、艾滋病和癌症引起的贫血也有一定疗效，还可用于择期手术的自身输血血液储备等方面。此外，EPO 还被用于治疗寄生虫病患者的贫血和皮肤溃疡［15］。

2 促红细胞生成素长效化技术

由于传统 EPO 药物在体内半衰期较短，在治疗时需要大剂量频繁给药，给患者的身体和经济带来较大压力，因此自重组人 EPO 药物被应用于临床治疗开始，人们就开始探索 EPO 的长效化技术。重组人 EPO 药物的首创者Amgen再次在长效 EPO 研制中走在世界的前面。2001 年，Amgen研制的长效 EPO 制剂新红细胞生成刺激蛋白（NESP）率先获得欧洲药物评审委员会批准用于治疗慢性肾衰（chronic renal failure，CRF）引起的贫血。NESP 在人体内的半衰期为 36 h，4 倍于 rhEPO（4 ～ 8 h），可将给药频率降低为每周一次或隔周一次［19］。NESP 的成功推动了其他长效 EPO技术的开发。

2.1 主要 EPO 药物长效化技术介绍

2.1.1 糖基化 作为一种糖蛋白类激素，糖基化水平和形式对 EPO 的体内生物学活性和稳定性扮演着至关重要的角色［20］。研究发现，糖基化可以增加蛋白质在变性条件下（如变性剂、热等）的稳定性，防止蛋白质分子聚集沉降［21］。

同时，糖链还可以占据蛋白质表面的蛋白酶降解位点，从而降低蛋白质被蛋白酶降解的可能性［22］。Amgen 的 NESP 即是受此启发，在 33 和 88 位各增加了一个 N-糖基化位点，

以延长 NESP 在体内的半衰期［19］。在国内，沈阳三生药业正在研发的 NuPIAO 通过增加 N 糖基化位点和唾液酸延长了 EPO 在体内的半衰期，目前进入 I 期临床实验阶段。目前，主要通过糖基化工程的手段对蛋白质表面的糖基化进行改良。这种改造可以通过氨基酸定点突变来增加或减少糖基化位点来实现［20］，也可以在体外通过化学法或酶法对糖链进行修饰［23-24］。用基因工程手段改变蛋白发酵中宿主细胞内糖基化代谢途径中相关酶的表达与活性，也可以改变在该系统中表达的蛋白质的糖基化形式［25］。

2.1.2 EPO 二聚体 EPO 二聚体在 20世纪 90 年代开始被研究［26］，研究发现其药代动力学性质与单体相似［27］，而其在体内的半衰期（可达 24 h）明显长于单体［27-28］，并且具有高于单体数倍的促进红细胞再生能力［27］。这种生物学活性的增高可能是由于两个 EPO 分子融合可以提供两个紧密连结的 EPO 受体高亲和力结构域，从而在与 EPO

受体结合时引发受体桥联继而构象改变，增加其信号传导效率［26］。目前，构建 EPO 二聚体的方法主要是化学交联和重组 DNA 介导的编码区融合，均能获得比天然单体更稳定，

活性更高的蛋白［28-29］。在国内，长春博泰医药生物技术有限公司曾研发过一种 EPO 二联体融合蛋白，展示出良好的体外活性［30］，但未见后续研发进展的报告。

2.1.3 EPO 的 Fc 融合蛋白 人 IgG 免疫球蛋白在体内的半衰期长达 21 d。而将人 IgG 的 Fc 片段与其他蛋白结合形成融合蛋白，亦可大幅延长融合蛋白的半衰期［31-32］。但是，Fc 片段可以在人体内活化 Fc 受体和补体途径，因此会引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）和补体依赖性细胞毒作用（CDC）［32］。这种性质对用作拮抗剂的蛋白药物影响较小，但是如果将用作激动剂的蛋白药物（如EPO）与 Fc 片段融合则会对药效产生严重干扰。目前，主要通过基因工程方法突变或删除 Fc 区域与受体和补体结合部位的关键氨基酸来实现减少融合蛋白在体内的 ADCC 和 CDC 作用。

最新的研究表明，使用由 IgD 的 CH2 区和 IgG4 的CH3 区融合而成的混合 Fc（hybrid Fc）片段，既可以拥有如 IgG 一样的较长的半衰期，又具有 IgD 那样不激活补体途径的性质（高浓度的 IgD Fc 碎片可以激活补体旁路途径），避免干扰药效发挥的 CDC 作用［33］。另外，Fc 片段可能因空间位阻问题降低融合蛋白的生物学活性，因此在主体蛋白和 Fc 片段之间需要一个弹性非常好的铰链区分隔［33］。目前国际上还没有 EPO 的 Fc 融合蛋白药物上市，但是其他 Fc 偶联蛋白药物已有成功上市的先例，如Enbrel（TNFR-Fc）、Orencia（CTLA4-Fc）等。在国内，百泰生物药业目前正在研发的 NESP/IgG2 融合蛋白在不降低 NESP 原有体内活性的基础上可将其半衰期进一步延长4.4 倍（大鼠）。

2.1.4 聚乙二醇化学修饰 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是环氧乙烷的寡聚物和聚合物的统称，用聚乙二醇链来修饰蛋白质可以保护蛋白多肽结构并减少肾对其的排泄作用，延长其半衰期和降低其血浆清除率［34］。PEG 修饰的糖基化 rhEPO 在人体内的半衰期是未经修饰的糖基化rhEPO 的 6 倍［34-35］。另外，PEG 的免疫原性非常低，可以避免服药后在体内产生 PEG 的抗体［34］。PEG 链的大小对其修饰的蛋白的体内半衰期和体外生物活性至关重要：链越大在体内的清除率越低，半衰期也就越长；但更长的 PEG链也会导致修饰的蛋白生物学活性下降［34-35］。因此，在对目的蛋白药物进行修饰时应选择适当的 PEG 链长度和分支形式。

目前唯一上市的 PEG 化 rhEPO 药物是罗氏的Mircera（CERA®），它分别在罗氏原有药物 Epogin 的 N 端52位和 45 位赖氨酸残基上通过氨基偶联了 30 kD 的甲氧基 PEG 链［36-37］。这种革命性的药物是目前唯一一种每月只需打一针的持续红血球生成素受体激动药。

2.1.5 EPO 的人绒毛膜促性腺激素亚基融合蛋白 人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）是一种糖蛋白类激素，由一个含 92 个氨基酸残基的 α 亚基和一个含 145 个氨基酸残基 β 亚基构成异源二聚体。其α 亚基与促黄体素（LH）、促滤泡素（FSH）和促甲状腺激素（TSH）的 α 亚基相同，β 亚基则不同。其中，hCG 的 β 亚基（hCG）的羧基端带有四个 N-连接寡糖识别位点［38］。

研究表明，将 hCG 带有四个 N-连接寡糖链的羧基端与人促滤泡素（FSH）、促甲状腺激素（TSH）组成融合蛋白，不会影响这些激素的富集、分泌和与受体的亲和力，但是能够显著提高这些蛋白的体内生物学活性和在血液循环中的半衰期［39-41］。随后，将 hCG 与 EPO 形成融合蛋白以延长 EPO 在体内半衰期的试验也取得了成功［42-43］。

另外，人促血小板生成素（human thrombopoietin，hTpo）的羧基端部分存在大量亲水的氨基酸残基和 6 个 N 端糖基化位点，被认为具有稳定蛋白结构的作用［44-45］。与 EPO进行的融合表达试验也证明，hTpo 的羧基端可以延长 EPO在体内的半衰期［46］。以上的研究表明，用富含糖链的肽段与 EPO 融合表达，可以提高 EPO 的半衰期。上述研究尚未应用于企业的药物开发中，但对未来嵌合 EPO 药物的研发带来启示。

图1 rhEPO-Fc 对体内网织红细胞生成的促进作用

2.2 长效 EPO 融合蛋白的药理学研究

在新型 EPO 药物中，高糖基化产品已经上市应用多年，其临床药理、药代方面的研究已经比较丰富，本文将着重介绍更新一代的长效化 EPO 品种，主要是 EPO 的 Fc融合蛋白在药理学研究方面的进展情况。目前，抗体 Fc 融合蛋白技术的实用性已经在商业化产品中得到认可，如CTLA-4-Fc（Orencia、Apatacept），LFA3-Fc（Amevive）和TNFR-Fc（Enbrel）［47］。尽管促红细胞生成素类药物尚没有Fc 融合蛋白产品上市，但是企业界与学术界对其体内外的药理、药效的研究热情由来已久，并已经显示了积极的结果。

上海维亚生物技术公司曾联合复旦大学检测了其研发的 EPO 的 IgG2 Fc 融合蛋白（Fc 片段经改造去除了CDC 和 ADCC 活性［48-49］）在大鼠、小鼠和恒河猴中的体内药理和药代。结果显示，经皮下注射给药，该 rhEPO-Fc 融合蛋白在恒河猴血浆中峰浓度和 AUC（0 ～ 168 h）均与注射剂量正相关，而达峰时间、血浆清除率和半衰期则与剂量无关；其中，该药血清中半衰期为 29.5 ～ 38.9 h。在大鼠模型中，该 rhEPO-Fc 融合蛋白表现出相似的药代动力学，其半衰期达到 35.5 ～ 43.5 h。而该药物对射线照射诱导（小鼠）、部分肾切除诱导（大鼠）和环磷酰酯诱导（恒河猴）的贫血症状均有剂量依赖性的改善［50］。另外，百泰生物药业研发的 NESP/IgG2 融合蛋白经静脉注射给药，在近交系雌性 Balb/C 小鼠中表现出与 rhEPO 相同的促红细胞生成活性（图 1），而半衰期达到 53 h。

在国外，使用由 IgD 的 CH2 区和 IgG4 的 CH3 区融合而成的混合 Fc 片段制成的新型 EPO-Fc 融合蛋白GX-E2 已经进入 I 期临床实验［51］。该蛋白在之前的动物实验中表现出比 Aranesp 更长的血清半衰期（31.6 h vs 15.6 h）［52］。而在药效方面，GX-E2 在注射后 10 ～ 40 d 提高血清中血红蛋白水平的能力也显著强于 Aranesp［52］。另外，在食蟹猴模型中，反复 9 次给药后未检测到受试动物体内有针对 GX-E2 的抗体被诱导出来，说明这种融合蛋白的免疫源性很低［52］。以上结果均显示了 EPO-Fc 融合蛋白良好的成药潜力，很可能成为 EPO 药物市场未来的重要增长点。

3 展望

综上所述，近年来 EPO 药物长效化技术有了长足发展，其中比较成熟并已应用于实际生产中的方法主要是对rhEPO 进行糖基化修饰、抗体 Fc 片段融合和 PEG 化（糖基化修饰经常和 Fc 融合蛋白结合使用）。其中，EPO 的Fc 融合蛋白由于构建和纯化比较方便将成为未来长效EPO 药物的主流，而对融合的 Fc 片段进行基因工程的突变改造以降低其体内 ADCC 和 CDC 活性将成为未来长效 EPO 研发的主要目标和创新点。另外，设计一个合适的具有弹性的铰链区连结 EPO 和 Fc 片段也是研发的一个重要课题。

［1］Lai PH， Everett R， Wang FF， et al. Structural characterization of human erythropoietin. J Biol Chem， 1986， 261（7）：3116-3121.

［2］Imai N， Kawamura A， Higuchi M， et al. Physicochemical and biological comparison of recombinant human erythropoietin with human urinary erythropoietin. J Biochem， 1990， 107（3）：352-359.

［3］Sasaki H， Bothner B， Dell A， et al. Carbohydrate structure of erythropoietin expressed in Chinese hamster ovary cells by a human erythropoietin cDNA. J Biol Chem， 1987， 262（25）：12059-12076.

［4］Takeuchi M， Takasaki S， Miyazaki H， et al. Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem， 1988， 263（8）：3657-3663.

［5］Youssoufian H， Longmore G， Neumann D， et al. Structure， function，and activation of the erythropoietin receptor. Blood， 1993， 81（9）：2223-2236.

［6］Jelkmann W， Bohlius J， Hallek M， et al. The erythropoietin receptor in normal and cancer tissues. Crit Rev Oncol Hematol， 2008， 67（1）：39-61.

［7］Socolovsky M， Fallon AE， Wang S， et al. Fetal anemia and apoptosis of red cell progenitors in Stat5a-/-5b-/- mice： a direct role for Stat5 in Bcl-X（L） induction. Cell， 1999， 98（2）：181-191.

［8］Gobert S， Duprez V， Lacombe C， et al. The signal transductionpathway of erythropoietin involves three forms of mitogen-activated protein （MAP） kinase in UT7 erythroleukemia cells. Eur J Biochem，1995， 234（1）：75-83.

［9］Miura Y， Muira O， Ihle JN， et al. Activation of the mitogen-activated protein kinase pathway by the erythropoietin receptor. J Biol Chem，1994， 269（47）：29962-29969.

［10］Verdier F， Chretien S， Billat C， et al. Erythropoietin induces the tyrosine phosphorylation of insulin receptor substrate-2. An alternate pathway for erythropoietin-induced phosphatidylinositol 3-kinase activation. J Biol Chem， 1997， 272（42）：26173-26178.

［11］Gregory CJ， Eaves AC. Human marrow cells capable of erythropoietic differentiation in vitro： definition of three erythroid colony responses. Blood， 1974， 49（6）：855-864.

［12］Gregory CJ， Eaves AC. Three stages of erythropoietic progenitor cell differentiation distinguished by a number of physical and biologic properties. Blood， 1978， 51（3）：527-537.

［13］Stohlawetz PJ， Dzirlo L， Hergovich N， et al. Effects of erythropoietin on platelet reactivity and thrombopoiesis in humans. Blood， 2006，95（9）：2983-2989.

［14］Kimata H， Yoshida A， Ishioka C， et al. Human recombinant erythropoietin directly stimulates B cell immunoglobulin production and proliferation in serum-free medium. Clin exp immunol， 1991，85（1）：151-156.

［15］Cuzzole M， Mercurial F， Brugnara C. Use of recombinant human erythropoietin outside the setting of uremia. Blood， 1997， 84（12）：4248-4267.

［16］Gao YL. EPO market status and outlook. Chin New Drugs J， 2001，10（2）：147-150. （in Chinese）高云莉. EPO的市场现状及展望. 中国新药杂志， 2001， 10（2）：147-150.

［17］Littlewood TJ. Erythropoietin for the treatment of anemia associated with hematological malignancy. Hematol Oncol， 2001， 19（1）：19-30.

［18］Yang M， Butler M. Effects of ammonia on CHO cell growth，erythropoietin production， and glycosylation. Biotechnol Bioeng，2000， 68（4）：370-380.

［19］Egrle JC， Browne JK. Development and characterization of novel erythropoietin stimulating protein （NESP）. Br J Cancer， 2001，84 Suppl 1：3-10.

［20］Eliott S， Lorenzini T， Asher S， et al. Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through glycoengineering. Nat Biotechnol，2003， 21（4）：414-421.

［21］Kwon KS， Yu MH. Effect of glycosylation on the stability of alpha1-antitrypsin toward urea denaturation and thermal deactivation. Biochem Biophys Acta， 1997， 1335（3）：265-272.

［22］Suzuki S， Furuhashi M， Suganuma N. A additional N-glycosylation at Asn（13） rescues the human LHbeta-subunit from disulfide-linked aggregation. Mol Cell Endocrinol， 2000， 160（1-2）：157-163.

［23］Lloyd RC， Davis BG， Jones JB. Site-selective glycosylation of subtilisin Bacillus lentus causes dramatic increases in esterase activity. Bioorg Med Chem， 2000， 8（7）：1537-1544.

［24］Raju TS， Briggs JB， Chamow SM. Glycoengineering of therapeutic glycoproteins： in vitro galactosylation and sialylation of glycoproteins with terminal N-acetylglucosamine and galactose residues. Biochemistry， 2001， 40（30）：8868-8876.

［25］Davies J， Jiang LY， Pan LZ， et al. Expression of GnTIII in a recombinant anti-CD20 CHO production cell line： Expression of antibodies with altered glycoforms leads to an increase in ADCC through higher affinity for FC gamma RIII. Biotech Bioeng， 2001，74（4）：288-294.

［26］Philo JS， Aoki KH， Arakawa T， et al. Dimerization of the extracellular domain of the erythropoietin （EPO） receptor by EPO： one high-affinity and one low-affinity interaction. Biochem， 1996， 35（5）：1681-1691.

［27］Dalle B， Henri A， Rouyer-Fessard P， et al. Dimeric erythropoietin fusion protein with enhanced erythropoietic activity in vitro and in vivo. Blood， 2001， 97（12）：3776-3782.

［28］Sytkowski AJ， Lunn ED， Davis KL， et al. Human erythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo activity. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 95（3）：1184-1188.

［29］Sytkowski AJ， Lunn ED， Risinger MA， et al. An erythropoietin fusion protein comprised of identical repeating domains exhibits enhanced biological properties. J Biol Chem， 1999， 274（35）：24773-24778.

［30］Zhang CL， Zhu X， Li JL. Status quo of new type of erythropoietin. Chin J Biologicals， 2004， 17（2）：123-125. （in Chinese）张春莉， 朱迅， 李景利. 新型促红细胞生成素研究现状. 中国生物制品学杂志， 2004， 17（2）：123-125.

［31］Capon DJ， Chamow SM， Mordenti J， et al. Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy. Nature， 1989， 337（6207）：525-531. ［32］Chamow SM， Ashkenazi A. Immunoadhesins： principles and applications. Trends Biotechnol， 1996， 14（2）：52-60.

［33］Yang SH， Yang SI， Chung Y. A long-acting erythropoietin fused with noncytolytic human Fc for the treatment of anemia. Arch Pharm Res，2012， 35（5）：757-759.

［34］Veronese FM， Pasut G. PEGylation， successful approach to drug delivery. Drug Discov Today， 2005， 10（21）：1451-1458.

［35］Stigsnaes P， Frokjaer S， Bjerregaard S， et al. Characterisation and physical stability of PEGylated glucagon. Int J Pharm， 2007， 330（1-2）：89-98.

［36］Agoram B， Aoki K， Doshi S， et al. Investigation of the effects of altered receptor binding activity on the clearance of erythropoiesisstimulating proteins： Nonerythropoietin receptor-mediated pathways may play a major role. J Pharm Sci， 2009， 98（6）：2198-2211.

［37］Macdougall IC， Eckardt KU. Novel strategies for stimulating erythropoiesis and potential new treatments for anemia. Lancet， 2006，368（9539）：947-953.

［38］Matzuk MM， Hsueh AJW， Lapolt P， et al. The biological role of the carboxyl-terminal extension of human chorionic gonadotropin ［corrected］beta-subunit. Endocrinology， 1990， 126（4）：376-383.

［39］Fares FA， Suganuma N， Nishimori K， et al. Design of a long-acting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit. Proc Natl Acad Sci U S A， 1992， 89（10）：4304-4308.

［40］LaPolt PS， Nishimori K， Fares FA， et al. Enhanced stimulation of follicle maturation and ovulatory potential by long acting follicle-stimulating hormone agonists with extended carboxyl-terminal peptides. Endocrinology， 1992， 131（6）：2514-2520.

［41］Joshi L， Murata Y， Wondisford FE， et al. Recombinant thyrotropin containing a beta-subunit chimera with the human chorionic gonadotropin-beta carboxy-terminus is biologically active， with a prolonged plasma half-life： role of carbohydrate in bioactivity and metabolic clearance. Endocrinology， 1995， 136（9）：3839-3848.

［42］Fares F， Ganem S， Hajouj T， et al. Development of a long-acting erythropoietin by fusing the carboxyl-terminal peptide of human chorionic gonadotropin beta-subunit to the coding sequence of humanerythropoietin. Endocrinology， 2007， 148（10）：5081-5087.

［43］Fares F， Havron A， Fima E. Designing a long acting erythropoietin by fusing three carboxyl-terminal peptides of human chorionic gonadotropin β subunit to the N-terminal and C-terminal coding sequence. Int J Cell Biol， 2011， 2011：275063.

［44］Kausnansky K. Thrombopoietin： the primary regulator of platelet production. Blood， 1995， 86（2）：419-431.

［45］Lok S， Foster DC. The structure， biology and potential therapeutic applications of recombinant thrombopoietin. Stem Cells， 1994， 12（6）：586-598.

［46］Lee DE， Son W， Ha BJ， et al. The prolonged half-lives of new erythropoietin derivetives via peptide addition. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 339（1）：380-385.

［47］Huang C. Receptor-Fc fusion therapeutics， traps， and MIMETIBODY technology. Curr Opin Biotechnol， 2009， 20（6）：692-699.

［48］Sun LH， Sun B， Sun C. Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities： US， 20030082749. 2003-05-01.

［49］Yang JJ， Zhang XJ， Zhou J， et al. High expression， purification，quality control of rhEPO-Fc fusion protein. China Biotechnol， 2007，27（6）：6-9. （in Chinese）杨建军， 张昕泂， 周洁， 等. rhEPO-Fc融合蛋白的表达、纯化及质量研究. 中国生物工程杂志， 2007， 27（6）：6-9.

［50］Shi X， Yang J， Zhu H， et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant human EPO-Fc fusion protein in vivo. PLoS ONE，2013， 8（8）：e72673.

［51］Im SJ， Yang SI， Yang SH， et al. Natural form of noncytolytic flexible human Fc as a long-acting carrier of agonistic ligand， erythropoietin. PLoS ONE， 2011， 6（9）：e24574.

［52］Yang SH， Yang SI， Chung YK. A long-acting erythropoietin fused with noncytolitic human Fc for the treatment of anemia. Arch Pharm Res， 2012， 35（5）：757-759.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.03.012

十二五“重大新药创制”国家科技重大专项（2012ZX 09401002-006）

100176 北京，百泰生物药业股份有限公司

王浛，Email：caroldman@163.com

2015-03-27