透骨消痛颗粒干预OA早期 COX-2和iNOS表达的实验研究

高雪伟 （中船武汉六七二医院骨科，湖北 武汉 430079）

透骨消痛颗粒干预OA早期 COX-2和iNOS表达的实验研究

高雪伟 （中船武汉六七二医院骨科，湖北 武汉 430079）

目的：通过动物试验探讨透骨消痛颗粒对骨性关节炎早期环氧化酶-2（COX-2）和诱导性一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响，研究透骨消痛颗粒在膝骨性关节炎治疗中的相关作用机制．方法：新西兰大白兔采用改良Hulth法造模，造模成功后随机分成3组：模型组、对照组、实验组，和正常组共4组，分别灌胃给药4周后处死动物取材，并观测如下指标：关节腔大体观察，滑膜与软骨组织学观察；关节液内 NO、NOS、PGE2含量检测，滑膜软骨中iNOS、COX-2含量检测．结果：4周后关节液中 NO、NOS含量、PGE2浓度，滑膜和软骨中iNOS、COX-2含量，模型组、对照组、实验组均呈高表达，与正常组比较差异有显著性（P＜0．05）；对照组、实验组与模型组比较差异有显著性（P＜0．05）；对照组与实验组比较差异有显著性（P＜0．05）．结论：透骨消痛颗粒可通过抑制COX-2和 iNOS在 OA早期滑膜和软骨细胞中的表达及其诱导产物PGE2和 NO的生成，从而达到控制OA早期炎症、减轻疼痛、缓解症状的作用．

透骨消痛颗粒；骨性关节炎；滑膜；软骨；COX-2；iNOS；NO；PGE2

0 引言

骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种多发病，常见于中老年人群，在我国其患病率40岁以上人群为10%～17%，60岁以上为 50%，75岁以上则达80%，而该病最终致残率为53%［1］，是影响中老年人活动最常见的原因．透骨消痛颗粒重要成分为杭白芍、巴戟天、川芎和肿节风，全方具有补肝肾、强筋骨之功效．辅以活血化淤、舒筋通络、祛风除湿的治疗效果，对改善膝 OA的症状有着良好疗效．本课题拟通过动物试验探讨透骨消痛颗粒对 OA早期环氧化酶-2（COX-2）和诱导性一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响，探讨透骨消痛颗粒治疗膝 OA疗效作用机制．

1 材料和方法

1．1 实验动物 新西兰大白兔，6月龄，实验对象空腹体重为（2 100±100）g，雌性30只、雄性30只，全部由上海医用动物实验中心提供，并安全运输至实验地（福建省中西医结合研究院的动物中心进行），动物合格证号：SCXK（沪）2008-0009．经过适应性喂养1周．

1．2 药物制备 透骨消痛颗粒：所需中药颗粒剂均由福建省第二人民医院制剂室提供，制成水煎剂，每10 mL含生药1．12 g．壮骨关节丸（批准文号：国药准字Z44023377）；盐酸氯胺酮注射液（批准文号：国药准字H32O22820）；注射用青霉素钠80万 u（批准文号：国药准字H37021950）；灭菌注射用水（批准文号：国药准字H44020786）．

1．3 主要试剂 一氧化氮试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20081215）；一氧化氮合成酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20081215）；PGE2（ELISA试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供，批号：0811165）；诱导型一氧化氮合酶原位杂交试剂盒（武汉博士德生物试剂有限公司提供，批号20080908）；COX-2免疫组化全套试剂盒（武汉博士德生物试剂有限公司，批号：20060408）．

1．4 主要仪器 酶标仪（ELX808U），美国 BIO-TEK公司；半自动生化分析仪（BT224），意大利生物技术公司；离心机（DDL-5），上海安亭科学仪器厂；医用冰箱（MDF-U5410），SANYO；电热恒温培养箱（DNP-9082），上海精宏实验设备有限公司；电热恒温水浴箱（HH1600），上海跃进医疗器械厂；微量振荡器（ZW-A），常州国华电器有限公司；全自动酶标洗板机（ELx50），美国BIO-TEK公司．

1．5 动物分组及实验方法 采用抽签法随机分为正常组（15只）和造模组（45只）．正常组兔子予以正常饲养看护；造模组兔子在常规术前准备基础上行改良Hulth法造模［2］．造模成功后再用抽签法随机分成3组：模型组、对照组、实验组，每组15只（表1）．模型组兔子予以生理盐水10 mL／d灌胃处理；对照组兔子则用壮骨关节丸水溶液10 mL／d（含壮骨关节丸1．12 g）灌胃处理；实验组给予透骨消痛颗粒水溶液10 mL／d（含生药量1．12 g）灌胃，共4周．

表1 动物分组及实验方法 （n＝15）

在驱赶过程中，兔群相互挤压、踩塌造成外伤致死有2只，分别在模型组和实验1组；在灌胃过程中，药物溶液返流导致误吸死亡4只，模型组、对照组、实验1、2组各1只．

1．6 标本取材 采用耳缘静脉麻醉的方法对药物干预4周的兔子进行麻醉，将麻醉后的兔子于右膝半屈曲位置于实验台，定位关节腔穿刺点，缓慢注入 1 mL生理盐水，之后反复活动关节，待充分接触后抽取关节液至EP管内，4 000 r／min离心 10 min取上清液，在 －20℃环境下保存．处死并解剖兔子，观察关节腔结构．刀片切取大小约为0．5 cm×0．5 cm×0．5 cm的内侧滑膜组织块，胫骨、股骨髁关节软骨修成0．5 cm×0．5 cm合适厚度软骨片．

1．7 组织学及生化检测 滑膜和软骨标本经4%多聚甲醛溶液固定24～48 h，脱水处理并石蜡包埋，3 μm连续切片后 HE染色、光镜下组织学观察．节液中NO、NOS活性采用分光光度计进行检测，PEG2采用PGE2（ELISA）试剂盒进行检测，软骨和滑膜组织中 iNOS采用iNOS试剂盒测定含量，滑膜、软骨COX-2表达采用免疫组织化学方法进行检测．

1．8 统计学处理 采用 SPSS18．0统计软件进行数据录入及分析，计数资料采用 χ2检验，P＜0．05时认为差异具有统计学意义．

2 结果

2．1 关节腔大体形态学观察 正常组关节软骨外观呈浅蓝白色，半透明；关节面光滑平整、色泽明亮，无裂纹及软化灶；关节边缘整齐规则，无骨赘形成．滑膜外观呈白色，润泽明亮，内表面光滑白亮向关节腔突出形成常说的滑膜皱襞；关节液呈淡黄色纯净液体，量少质稠．模型组关节软骨呈淡黄色；关节表面粗糙糜烂、溃疡形成，失去光泽，软骨缺损浅深不一，以致软骨剥脱，软骨下骨质暴露；关节边缘不规则，有明显骨赘次形成．滑膜外观明显增生肥厚粘连；关节液明显增多，色质浑浊．对照组关节腔大体形态学变化介于模型组和实验组之间．实验组关节软骨呈微黄色，关节面光泽尚存，关节表面部分粗糙未见明显糜烂、溃疡，软骨部分区域缺损较表浅，未见大面积剥脱，软骨下骨质未见明显暴露；关节边缘欠规则，可见少量骨赘形成．滑膜外观部分增生肥厚及粘连；关节液增多，色质稍浑浊．

2．2 滑膜及软骨组织学观测 正常组滑膜完整，细胞排列整齐，无充血水肿、无炎性细胞浸润（图1A）．模型组滑膜肉芽组织纤维化（瘢痕形成），伴有淋巴细胞和浆细胞浸润（图1B）．对照组滑膜细胞呈乳头状增生，滑膜内血管增生，肉芽组织形成（图1C）．实验组滑膜充血水肿，表层细胞增生（图1D）．

图1 滑膜及软组织学观测（×100）

2．3 关节液中 NO、NOS、PGE2含量测定 表 2显示，模型组、对照组、实验组关节液中NO、NOS、PGE2含量均呈高表达，与正常组相比差异具有显著性（P＜0．05），说明在膝 OA早期发病过程中是重要的炎症介质．关节液中的 NO、NOS含量对照组、实验组与模型组有显著性差异（P＜0．05），对照组与实验组相比有显著性差异（P＜0．05）．对照组、实验组与模型组在关节液中 PGE2含量上有显著差异（P＜0．05），且对照组与实验组两者相比较，同样具有差异（P＜0．05），差异有统计学意义．

表2 关节液 NO、NOS、PGE2测定结果比较 （±s）

表2 关节液 NO、NOS、PGE2测定结果比较 （±s）

aP＜0．05 vs正常组；cP＜0．05 vs模型组；eP＜0．05 vs对照组．

组别 n NO（mmol／L） NOS（U／mL） PGE2（pmol／L）

2．4 滑膜和软骨中 iNOS测定 表3显示，模型组、对照组、实验组中 iNOS均呈高表达，与正常组相比差异具有显著性（P＜0．05），说明在膝OA早期发病炎症病变过程中是重要的酶介质．滑膜和软骨中 iNOS含量对照组、实验组与模型组有显著性差异（P＜0．05），对照组与实验组相比有显著性差异（P＜0．05）．

表3 滑膜和软骨中 iNOS测定结果比较±s，u／mg）

表3 滑膜和软骨中 iNOS测定结果比较±s，u／mg）

aP＜0．05 vs正常组；cP＜0．05 vs模型组；eP＜0．05 vs对照组．

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2．5 滑膜、软骨 COX-2表达结果 表4显示，正常组、对照组及实验组均高于模型组（P＜0．05）；实验组高于对照组（P＜0．05），差异具有统计学意义．以上数据表明，实验组 COX-2的阳性表达要弱于模型组及对照组．

表4 滑膜和软骨中 COX-2阳性表达灰度值（±s）

表4 滑膜和软骨中 COX-2阳性表达灰度值（±s）

aP＜0．05 vs正常组；cP＜0．05 vs模型组；eP＜0．05 vs对照组．

组别 n 滑膜 软骨正常组15 213±14 235±23模型组 13 139±14a145±15a对照组 14 225±13ac213±15ac实验组 14 229±15ace221±13ace

3 讨论

膝OA在祖国医学中当属痹证范畴，根据“痛着不通，不通则痛”的中医理论，膝OA出现膝关节疼痛时定有“瘀”，此瘀当责之于肝肾，肝肾气血亏虚，气虚则血运无力，渐可致瘀．而且本病多见于老年肥胖女性，中医素有“肥人多痰”的理论，故本病尚涉及脾［3－4］．治则以补虚为先，阴阳共补，阴中求阳．结合本病特点，宜壮阳稍强，以求平衡阴阳兼有祛邪；活血化瘀应兼行气止痛；血不养筋、寒之收引易致筋脉拘挛，所以柔肝舒筋之药不可少；且勿忘健脾调胃．以达利湿化痰的目的．所以，本方以补肾作为治疗膝 OA的根本法则，兼以补肾养肝，活血健脾，利湿化痰．

国内外大量的实验研究表明，导致膝关节 OA病理变化的炎症途径中，NO和 COX-2起到很重要的作用，两项由炎症因子介导的炎症途径是通过对滑膜和软骨营养交换、骨基质合成、轻微损伤后修复等途径的干预和损害，导致OA病理过程中关节软骨的软化、纤维化、溃疡，软骨下骨的硬化与象牙化，骨赘形成和软骨下骨囊肿，以及滑膜组织损伤和血管扩张，组织渗出，导致滑膜肿胀，造成关节腔积液、滑膜增生肥厚粘连软骨，以上所述病理变化最终导致患者出现膝关节的疼痛、肿胀、关节活动功能减退以致障碍［5－7］．透骨消痛颗粒是以“肾主骨”、“肝主筋”、“膝为筋之府”等中医药理论为指导，以补肾作为治疗膝 OA的根本法则（药以巴戟天等温阳补肾之品治本；刘献祥等在透骨消痛颗粒防治膝骨性关节炎的机理研究中将其简要的归纳为五要：①补肾要去邪，邪去痹自灭；②补肾要活血，血行痹自解；③补肾药健脾，脾健痹自去；④补肾药养肝，肝肾同源，肝肾痛健痹自歼；⑤补肾药止痛，痛解痹自停．

本实验研究过程用改良HUILTH法复制兔膝关节OA模型，实验标本采集检测及观察，可显示膝关节OA病理变化过程中的软骨的软化、纤维化，减少溃疡和软骨下骨的硬化与象牙化，降低软骨下骨囊肿与骨赘形成，控制滑膜组织的损伤和渗出．保护血管，减轻其因扩张而导致的滑膜肿胀、关节腔积液、滑膜增生肥厚粘连软骨等标志性的病变，可以印证大多数相关研究中对应病理过程．在相关各组实验结果的对比中可以发现，透骨消痛颗粒在膝 OA病理变化可以起到减轻 OA病理变化中的关节软骨和滑膜的退变，减轻膝关节的肿胀、疼痛、关节功能退变．试验结果可证实在兔膝关节OA过程中NOS和COX-2途径起到了重要作用，透骨消痛颗粒可以抑制这两条炎症途径．

［1］刘献祥，李西海，周江涛．改良 Hulth造模法复制膝骨性关节炎的实验研究［J］．中国中西医结合杂志，2005，25（12）：1104－1106．

［2］郑永智，孙永强，王上增．关节镜治疗膝关节骨性关节炎化脓性感染的临床分析［J］．中华医院感染学杂志，2014，24（15）：3815－3817．

［3］黄云梅，陈文列，林如辉，等．透骨消痛胶囊促进成骨细胞的增殖和分化［J］．中国组织工程研究，2013，17（33）：5923－5928．

［4］陈 燕，肖晓金，包侠萍，等．透骨消痛方镇痛抗炎作用实验研究［J］．中医学报，2013，28（11）：1675－1676，1685．

［5］袁望舒，陈丽霞，刘淑芬．负重游泳运动对膝骨性关节炎大鼠关节软骨及血清超氧化物歧化酶和丙二醛的影响［J］．中华物理医学与康复杂，2014，36（2）：81－85．

［6］吴汝平，赵品益．中医手法联合关节腔内注射玻璃酸钠治疗膝骨性关节炎临床分析［J］．中华中医药学刊，2014，32（5）：1219－1221．

［7］瓮长水，郭燕梅，陈 蔚，等．80岁及以上膝骨性关节炎患者等速肌力与疼痛和功能状态的关系［J］．中华老年医学杂志，2014，33（7）：718－721．

The Experimental Research about granula of penetrating bone removeing pain intervene the expression of COX-2 and iNOS in early stage of osteoarthritis

GAO Xue-Wei
The 672 Hospital of Wuhan，Department of Orthopaedic，Wuhan 430079，China

AIM：To investgate the mechanism of influence about granula of penetrating bone removeing pain intervene the expression of COX-2 and iNOS in early stage of osteoarthritis by animals experiment，to investgate mechanism of granula of penetrating bone removeing pain on treatment of osteoarthritis．METHODS：We devided the New Zealand rabbits into 3 groups randomly after replicated knee osteoarthritis with modified Hulth modeling method：model group，control group，experimental group，with the normal group were 4 groups in total．We execute all rabbits after they were fed intragastically for 4 weekes．Then the following detection were taken out：General Observation of articular cavity；histological Conversation of synovium and cartilage；content of NOS，NO，test of iNOSmRNA，concentration of COX-2 and PGE2 within joint．RESULTS：After four weekes，there was significant contrast（P＜0．05）of the concent of NOS，NO，iNOSmRNA，COX-2 and PGE2 of model group，control group，experimental group compared with the normal group；There was significant contrast（P＜0．05）of the concent of NOS，NO，iNOSmRNA，COX-2 and PGE2 of experimental groups and control group compared with the model group；There was significant contrast（P＜0．05）of the concent of NOS，NO，iNOSmRNA，COX-2 and PGE2 of experimental group compared with control group．CONCLUSION：The granula of penetrating bone removeing pain can control inflammation，relieve pains and alleviate symptoms in early stage of osteoarthritis by inhibiting the expression of COX-2 and iNOS within cartilage and synovium and releving the production of PGE2 and NO which can be inducktived by COX-2 and iNOS．

granula of penetrating bone removeing pain；osteoarthritis；synovium；cartilage；COX-2；Inos；NO；PGE2

R274．32；R684．3

A

2095-6894（2015）01-015-04

2014-12-10；接受日期：2014-12-30

高雪伟．硕士．E-mail：119077056@qq．com