大鼠肾发育中Wnt4蛋白的表达

程文志，唐春光，宋小峰

大鼠肾发育中Wnt4蛋白的表达

程文志1,2，唐春光1,2，宋小峰1△

目的探讨大鼠肾发育中Wnt4蛋白的表达规律及Wnt4蛋白对大鼠肾发育的影响。方法选取胚龄（E）18、20 d和生后（P）0、1、3、5和7 d的大鼠肾脏，应用免疫组织化学技术，定性分析该时间段内大鼠肾组织中Wnt4蛋白的表达部位及其变化情况；应用蛋白印迹检法，定量分析该时间段内大鼠肾组织中Wnt4蛋白表达量的变化。结果免疫组化结果显示，从E 18 d～P 7 d，Wnt4蛋白在近端小管，在生肾区的输尿管芽、逗号小体以及S小体的表达较强，在远端小管的表达较弱，在肾小体的表达由强到弱。蛋白印迹检测结果显示，Wnt4蛋白的表达量E 18 d时开始逐渐降低，P 1 d时到达低点，然后开始回升，P 7 d时再次降低。结论在大鼠肾发育中，Wnt4蛋白通过启动经典的Wnt/β-catenin信号通路参与调控肾单位的发育，启动非经典的Wnt/PCP信号通路参与调控近端小管的延长，其可能与肾单位的形成以及近端小管的发育密切相关。

肾小管，近端；Wnt蛋白质类；大鼠,Sprague-Dawley；动物实验；Wnt信号通路；肾发育

Wnt信号通路由Wnt基因调控，在生物进化上高度保守，广泛存在于各种动物体内［1-2］。Wnt基因编码的分泌型Wnt糖蛋白是Wnt信号通路的起始蛋白。Wnt蛋白通过与膜受体结合进行信号转导［3］。Wnt信号通路在胚胎发育中调控细胞的增殖、分化、极性和迁移等［4］。根据信号转导方式的不同，Wnt信号通路可分为经典的Wnt/β-catenin、非经典的Wnt/ PCP和Wnt/Ca2+信号通路三类［5］。

目前，有关Wnt信号通路在大鼠肾发育中作用的研究尚少见，其对肾发育影响的研究有待深入。本研究旨在探讨Wnt4蛋白在大鼠肾发育中的表达部位和水平及其对大鼠肾发育的影响，为临床肾脏

病理学的研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料健康清洁级SD大鼠12只，雌、雄各半，体质量250～300 g，月龄5个月，购于辽宁医学院实验动物中心；小鼠抗大鼠Wnt4抗体［Wnt-4（B-6）:sc-376279］和小鼠抗大鼠β-actin内参抗体［β-actin（C4）:sc-47778］购于Santa Cruz Biotechnology公司；山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）抗体-HRP（PV-6002二步法免疫组化检测试剂）购于中杉金桥公司；Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）购于Jackson Immuno Research公司。

1.2 实验取材SD大鼠雌、雄同窝饲养，每日6：00、12：00及18：00观察受孕情况，观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄0 d（embryonic day 0，E 0 d）。孕鼠分笼饲养2周后，每日8：00和20：00观察生产情况，观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0 d（postnatal day 0，P 0 d）。选取E 18、20 d的胎鼠和P 0、1、3、5和7 d的仔鼠，各龄每组取6只。各孕龄鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，各龄胎鼠剖腹取肾；生后各龄仔鼠经乙醚麻醉后，剖腹取肾；左肾常规脱水透明，石蜡定向包埋，连续切片4 μm；右肾放入-80℃的冰箱中冻存备用。

1.3 免疫组化染色将石蜡切片脱蜡至水；用3%H2O2阻断内源性过氧化物酶；高温高压修复抗原，室温下冷却后加小鼠抗大鼠Wnt4抗体（1∶100）；以PBS代替一抗作阴性对照，湿盒内4℃过夜；加羊抗小鼠IgG抗体HRP，37℃20 min；DAB显色；苏木精复染、脱水、透明、封片，光镜下观察。观察到棕黄色颗粒为阳性。

1.4 蛋白印迹检测分别取-80℃冻存的各个时间点的大鼠肾组织5 g，清洗后将组织剪碎，匀浆；-20℃下20 000 r/min离心5 min后取上清液，加入考马斯亮蓝，测定并配平蛋白浓度。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后，转膜、封闭，加一抗（小鼠抗大鼠的Wnt4抗体和β-actin内参抗体，1∶500），4℃孵育过夜，加入二抗［Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG（H+L），1∶20 000］，室温下孵育2 h，滴加SuperSig⁃nal West Pico化学发光底物后观察显色，用Scion Image Beta 4.0.3图像灰度分析软件分析，以β-actin作为内参校正。

1.5 统计学方法采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果在E 18 d和E 20 d时，Wnt4蛋白在近端小管和肾小体，以及生肾区的输尿管芽、逗号小体和S小体表达较强，在远端小管表达较弱。在P 1 d～5 d时，Wnt4蛋白在近端小管和生肾区的输尿管芽，逗号小体和S小体的表达较强，但远端小管表达较弱，肾小体则表达较弱。P 7 d时，随着生肾区的消失，Wnt4蛋白在近端小管表达较强，远端小管表达较弱。见图1。

2.2 蛋白印迹检测结果E 18 d、E 20 d、P 0 d、P 1 d、P 3 d、P 5 d及P 7 d Wnt4蛋白的相对表达水平分别为0.661±0.087、0.576±0.065、0.508±0.073、0.283± 0.021、0.469±0.032、0.451±0.031及0.237±0.015（F= 27.535，n=6，P＜0.05）。Wnt4蛋白的相对表达水平从E 18 d时开始逐渐降低，P 1 d到达低点，然后开始回升，到P 3 d时停止回升，P 7 d时，Wnt4蛋白的表达量降到略低于P 1 d时的表达量，见图2。

Fig.2Expression levels of Wnt4 protein in rat kidney tissue at different time points图2 大鼠肾组织中Wnt4蛋白的表达

3 讨论

哺乳动物的后肾是永久肾。后肾是在输尿管芽和生后肾原基的相互诱导下，由生后肾原基分化为肾小体和肾小管，输尿管芽则逐渐分化为输尿管、肾盂、肾盏和集合管后，发育为成熟的肾脏［6］。

已有研究表明，Wnt蛋白家族的许多成员参与肾发育的调控［7］。其中Wnt4蛋白通过经典和非经典的Wnt信号通路发挥重要的调控作用［8-9］。Wnt4蛋白由后肾间充质产生，它启动经典的Wnt/βcatenin信号通路时，调控细胞的增殖，诱导小泡体转化为肾小囊的上皮结构，并参与肾小管的形成［9］；启动非经典的Wnt/PCP信号通路时，参与调节肾小管上皮细胞的极性，调控细胞的分裂和迁移，促进肾小管的延长，但不增加小管的直径［10］。

研究认为，Wnt/β-catenin信号通路的活性是生肾区内早期肾小管形成和输尿管芽分支所必需的，但其活性在肾单位成熟的部位逐渐减弱［11］。在小泡体或肾小囊形成的同时，其活性就转变为非经典信号通路，调节肾小管的延长［12］。在肾发育中，Wnt/βcatenin和Wnt/PCP信号通路之间的平衡很重要，二者间的平衡被打破将导致肾发育异常，甚至是肾祖细胞分化缺陷［10］。另有研究显示，经典信号通路的活性能抑制非经典信号通路的激活［13］。本研究结果显示，在E 18 d～P 7 d，Wnt4蛋白在近端小管表达较强，表明Wnt4蛋白此时在肾近端小管启动的是Wnt/PCP信号通路，调节肾小管上皮细胞的极性，进而调控近端小管的延长，提示在E 18 d～P 7 d时近端小管没有经典的信号通路被激活。Wnt4蛋白在肾小体内的表达，在E 18 d和E 20 d时较强，在P 1 d～7 d时呈整体减弱趋势，表明在胚胎期肾小体的

发育可能以调节上皮细胞的极性为主，生后其上皮细胞的极性已经完成，其发育可能转变为以细胞分化为主。同时，本研究亦显示，Wnt4蛋白在远端小管的表达较弱，提示远端小管的发育可能是由其他机制调控的，具体机制还有待进一步的研究。

本研究结果显示，在E 18 d～P 7 d，Wnt4蛋白在生肾区的表达较强，表明Wnt4蛋白在生肾区启动Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。在肾小囊形成之前，生肾区的发育是由Wnt/β-catenin信号通路调控。因此，此时生肾区没有非经典的信号通路被激活。

蛋白印迹检测结果显示，Wnt4蛋白的表达量在小鼠出生前从E18 d开始逐渐降低，在P 1 d时到达低点，考虑可能原因是由于大鼠出生后，从母体内进入自然界环境引发的应激性反应所致［14］。此外，有研究表明，肾小囊体积的增长速度在P 3 d～P 5 d时最快［15］。逗号小体和S小体的体积在生后3 d达到高峰，之后体积减小，生后7 d时消失［16］。本研究结果中，Wnt4蛋白含量的变化规律与上述文献中所述肾小囊和肾小体的变化规律相近，表明Wnt4蛋白与大鼠肾小囊体积的增加和肾小体的形成过程有关。

综上所述，笔者认为，在大鼠肾发育中Wnt信号通路中的Wnt4蛋白对肾单位的形成和近端小管的发育有重要的调控作用。近端小管是肾脏重吸收的重要部位，也是肾缺血再灌注损伤等肾疾病的易发部位。

（图1见插页）

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（2015-03-13收稿 2015-06-25修回）

（本文编辑 陆荣展）

The expression profile of Wnt4 in rat kidney during renal development

CHENG Wenzhi1,2,TANG Chunguang1,2,SONG Xiaofeng1△
1 Department of Histology and Embryology of Liaoning Medical University，Liaoning 121001，China；2 Library of Liaoning Medical University△

ObjectiveTo explore the expression profile of Wnt4 in rat kidney during renal development and its effect on renal development.MethodsRats with embryonic age of 18 days（E 18 d）,20 days（E 20 d）as well as postnatal age of 0 day（P 0 d）,1 day（P 1 d）,3 days（P 3 d）,5 days（P 5 d）and 7 days（P 7 d）were selected.Expression levels of Wnt4 in rat kidney during renal development were quantified by immunohistochemistry and Western blot in all time points.ResultsImmuno⁃histochemistry analysis showed that during E 18 d to P 7 d,Wnt4 mainly expressed in proximal tubules,ureteric bud,comma shaped bodies and S shaped bodies of nephrogenic zone；the expression in the distal tubule was weak；the expression in renal corpuscle decreased with time；Western blot analysis showed that the expression of Wnt4 in rat kidney began to decrease from E 18 d and reached bottom at P 1 d then rise again until P 7 d when it dropped again.ConclusionDuring renal development, Wnt4 proteins were involved in the development of the nephrogenic zone through regulating canonical Wnt/β-catenin signaling pathway,and was involved in extension of proximal tubules by inducing the non canonical Wnt/PCP signaling pathway.Expression of Wnt4 protein in rat kidney was closely related to nephron formation and development of proximal tubules.

kidney tubules,proximal；Wnt proteins；rats,Sprague-Dawley；animal experimentation；Wnt signaling pathway；kidney development

R334.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.011

国家自然科学基金资助项目（31200871）；辽宁省自然科学基金资助项目（201202146）

1辽宁医学院组织胚胎学教研室（邮编121001）；2辽宁医学院图书馆

程文志（1979），男，硕士在读，主要从事肾的发生发育研究

△通讯作者E-mail：songxfmm@sina.com