新生小鼠缺氧缺血性脑病脑组织caspase-3表达的变化

2015-11-24肖爱娇康明非汪建民罗小泉

天津医药 2015年10期

肖爱娇，康明非，汪建民，罗小泉

肖爱娇1，康明非2，汪建民3，罗小泉4

目的观察半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3在新生儿缺氧缺血性脑病（NHIE）小鼠模型脑组织中表达的变化。方法选取7 d CD1新生小鼠30只，按随机数字表法分为假手术组（9只）和NHIE模型组（21只），后者制备NHIE动物模型。用TTC染色法检查2组的脑组织梗死面积；DAPI染色观察脑组织病理变化；原位末端标记技术检测脑组织细胞凋亡；荧光免疫组化法检测脑组织中caspase-3表达水平。结果假手术组小鼠脑组织未见梗死灶，脑组织细胞排列致密整齐，TUNEL阳性细胞数［（18.57±4.98）个］和caspase-3阳性细胞数［（9.17±2.14）个］明显低于NHIE模型组的TUNEL阳性细胞数［（209.57±41.27）个］和caspase-3阳性细胞数［（63.33±16.22）个］；与假手术组相比，NHIE模型组小鼠的右侧半球可见梗死灶，脑组织细胞大量坏死脱落、周围组织间隙变大。结论NHIE模型鼠出现的脑组织损伤可能与caspase-3表达增加、脑组织细胞凋亡增加有关。

缺氧缺血；脑梗死；细胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；小鼠；缺氧缺血性脑病

新生儿缺氧缺血性脑病（neonatal hypoxic-isch⁃emic encephalopathy,NHIE）指各种围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致的胎儿或新生儿脑损伤［1］，是新生儿窒息后的严重并发症，较为常见，病情重且病死率高；并可产生永久性神经功能障碍，如智力低下、癫痫、脑性瘫痪、痉挛和共济失调等，严重影响患儿的生活质量，给社会和家庭造成沉重的负担。研究报道细胞凋亡参与了缺氧缺血性脑损伤的发病过程［2-3］。而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3是细胞凋亡的主要执行者，研究发现，NHIE模型鼠脑组织中caspase-3活性增加［4-5］，而NHIE模型鼠脑组织中caspase-3表达量是否增

加尚不清楚。本研究通过建立NHIE小鼠模型，观察脑组织损伤程度、细胞凋亡及caspase-3表达情况，为下一步研究药物的作用机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料出生7 d的CD1新生小鼠30只，雌雄不拘，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。TTC试剂（2,3,5-氯化三苯基四氮唑，Sigma）；凋亡原位检测试剂盒（S7165，Mil⁃lipore）；兔抗小鼠caspase-3（#9664,Cell Signaling Technolo⁃gy）；山羊抗兔（A11011,Invitrogen）；含DAPI的荧光封片剂（P36931，Invitrogen）。DL-SSJ头戴式手术显微镜（中国DL公司）；Leica荧光显微镜及图像分析软件（德国Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 NHIE新生鼠模型制备将小鼠按随机数字表法分为假手术组（9只）和模型组（21只）。模型组参照Rice-Van⁃nucci［6］和Levine［7］的方法制备NHIE鼠模型：给予异氟烷吸入麻醉，动物在麻醉状态下行颈部正中切口，分离右侧颈总动脉后用电凝法闭合颈总动脉，缝合伤口。术后动物在室温中恢复和母乳喂养2 h后，进行低氧处理：将动物置于37℃的密闭舱内，通入含5%CO2的N2，调节氧气浓度为8%，100 min后将动物取出，返回母鼠身边继续哺乳喂养。假手术组：只做手术，不闭合颈总动脉，不缺氧处理。

1.2.2 脑组织梗死检查于造模后1 d，给予动物异氟醚吸入麻醉后迅速取脑（假手术组6只，模型组18只），以1.5 mm左右间隔自额向枕切成4个冠状切片，加入1%TTC染液，置于37℃温箱中染色20 min，用扫描仪进行扫描，Image J软件测量每张脑片的梗死面积，并计算梗死体积百分比（%）=［健侧半球体积–（患侧半球体积–梗死体积）］/健侧半球体积× 100%［8］。

1.2.3 脑组织形态学观察于造模后7 d，给予动物异氟醚吸入麻醉后迅速取脑，数码相机拍照后切片，厚30 μm，用含DAPI的P36931荧光封片剂封片，显微镜下观察拍照。

1.2.4 脑组织细胞凋亡检测于造模后3 d，给予动物异氟烷吸入麻醉后迅速取脑（2组各3只），置于4%多聚甲醛溶液中固定，PBS清洗后进行切片，厚30 μm，置于1%多聚甲醛溶液中备用。随机抽取脑组织切片，每个标本取3～5片，按原位凋亡检测试剂盒说明书检测脑组织细胞凋亡，即PBS液清洗、末端脱氧核糖转移酶（TdT酶）工作液37℃孵育1 h、反应终止液、PBS液清洗、加入罗丹明标记物，室温下放置30 min，PBS液清洗后用普通荧光封片剂封片，荧光显微镜观察、拍照。图中红色为TUNEL染色阳性细胞，计数每个100倍视野下的TUNEL阳性细胞数。

1.2.5 脑组织caspase-3阳性细胞检测于造模后3 d，给予动物异氟烷吸入麻醉后迅速取脑，每组取3个标本，置于4%多聚甲醛溶液中固定，然后移至梯度蔗糖溶液中脱水。待组织块下沉后进行切片，厚30 μm，置于1%多聚甲醛溶液中备用。随机抽取脑组织切片，每个标本取3～5片，经PBS漂洗、正常血清封闭后加入兔抗小鼠caspase-3一抗（1∶250），4℃孵育过夜，阴性对照不加一抗，用PBS代替。PBS液洗后，加入山羊抗兔二抗（1∶500），室温下避光孵育1 h。PBS液洗后风干，用含DAPI的荧光封片剂封固，荧光显微镜观察、拍照。细胞中caspase-3蛋白呈现红色，DAPI呈现蓝色。用Image J软件进行图像分析，分别计算每张图片、每100倍视野下的caspase-3阳性细胞数。

1.3 统计学方法用软件SPSS 13.0进行分析，计量指标用表示，2组比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织梗死观察假手术组脑组织全部染成红色，未见梗死灶，见图1A。模型组左侧半球呈红色；右侧半球有白色梗死灶，见图1B。脑组织梗死体积百分比为（46.56±6.90）%。

Fig.1TTC staining of mice coronal section of brain图1 小鼠脑组织TTC染色结果

2.2 脑组织形态学观察

2.2.1 大体观察假手术组脑组织红润，脑沟及脑回清晰，见图2A。模型组右侧脑组织表面苍白、出现液化，且脑沟变浅、脑回变宽，见图2B。

2.2.2 镜下观察假手术组小鼠脑组织细胞排列致密、整齐，见图3A。模型组小鼠患侧脑组织大量细胞坏死、脱落，周围间隙增大，见图3B。

2.3 脑组织TUNEL阳性细胞数假手术组小鼠右侧脑组织TUNEL阳性细胞数明显低于模型组（P＜0.05），见图4、表1。

Tab.1Number of TUNEL-positive cells and caspase-3-positive cells in two groups of rats表1 2组小鼠脑组织中TUNEL阳性细胞数和caspase-3阳性细胞数比较

＊P＜0.05

组别假手术组模型组t n33 TUNEL阳性细胞数18.57±4.98 209.57±41.27 18.43＊caspase-3阳性细胞数9.17±2.14 63.33±16.22 8.110＊

2.4 脑组织caspase-3阳性细胞数假手术组小鼠右侧脑组织caspase-3阳性细胞数明显低于模型组（P＜0.05），见图5、表1。

3 讨论

NHIE是由各种因素（如宫内窘迫、脐带脱垂以及产妇休克等围产期因素）引起围产期窒息，进而导致脑的缺氧缺血性损伤［9］。据资料统计，NHIE占新生儿住院病例的18.1%。我国每年出生活产婴儿1 800万～2 000万，窒息发生率为13.6%，因为窒息导致伤残占窒息患儿的15.6%，每年大约有30万残疾儿童产生，严重危害了儿童的生活质量［10］。因而对该病的研究引起了广泛的关注。

许多疾病的研究都得益于成功的动物模型。由Rice［6］和Levine［7］建立的NHIE新生鼠模型是目前使用最多的模型。因此，本研究参照上述方法，采用单侧颈总动脉闭塞后再给予缺氧100 min制备NHIE新生小鼠模型，TTC染色和形态学观察结果显示：假手术组小鼠脑组织未见梗死灶，脑组织外观红润，组织细胞排列致密、整齐；而模型组小鼠患侧半球可见梗死灶，患侧脑组织表面苍白、出现液化，组织细胞大量坏死脱落，周围间隙扩大。上述结果表明，颈总动脉闭塞后、缺氧100 min可造成脑组织损伤。然而脑组织损伤的病理机制却是相当复杂。

NHIE的病理机制很多，包括线粒体损伤、氧化应激、炎症反应、兴奋性毒性和细胞凋亡等。其中，细胞凋亡在缺氧缺血性脑损伤中的作用十分重要。本研究观察到，NHIE新生鼠模型脑组织中TUNEL阳性细胞数增加。表明细胞凋亡参与了新生鼠缺氧缺血性脑损伤的发生。与文献［2-3,11］研究结果相似。Caspase-3是细胞凋亡的主要执行者，其可通过多个途径作用于细胞骨架蛋白、DNA修复调节因子、细胞周期调节蛋白等，导致细胞DNA修复功能丧失、caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspases-acti⁃vated DNase，CAD）激活，导致DNA片段化，失去正常功能而凋亡［12］。据研究报道，NHIE模型鼠脑组织中caspase-3活性增加［4-5,13］。本研究观察到，NHIE模型小鼠患侧脑组织caspase-3阳性细胞数明显增多。上述研究结果表明，NHIE可能与caspase-3表达增多、导致细胞凋亡增加有关。

（图3～5见插页）

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（2015-04-10收稿 2015-06-10修回）

（本文编辑闫娟）

Increased expression of caspase-3 in ipsilateral neonatal hypoxic-ischemia encephalopathy model in mice

XIAO Aijiao1,KANG Mingfei2,WANG Jianmin3,LUO Xiaoquan4
1 Department of Physiology，2 Department of Rehabilitation of Affiliated Hospital，3 Department of Anatomy，4 Animal Experiment Center of Science and Technology，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China

ObjectiveTo observe apoptotic cells and caspase-3-positive cells in ipsilateral neonatal hypoxic-isch⁃emia encephalopathy（NHIE）model in mice.MethodsCD1 mice of age 7 days（n=30）were randomly divided into two groups:sham group（n=9）and model group（n=21）.NHIE model was induced by right common carotid artery ligation fol⁃lowed by 8%oxygen hypoxia for 100 min.TTC staining was used to determine area of brain infarction.DAPI staining was used to detect pathological change in brains.TUNEL assay was used to detect apoptotic cells and fluorescence immunohisto⁃chemistry was used to detect caspase-3 expression in the ipsilateral brain.ResultsNo infarct was detected in sham group. Cells were densely and orderly arranged in brain.TUNEL-positive cells（18.57±4.98）and caspase-3-positive cells（9.17± 2.14）in the ipsilateral brain were both less than those in the ipsilateral brain of mice in model group（209.57±41.27）and（63.33±16.22）respectively.Mice in model group presented infarct in the right hemisphere with more dead cells and wider in⁃terstitial space compared with sham group.ConclusionBrain injury in NHIE model might be related to the increasing cas⁃pase-3 expression thus leads to apoptosis.

hypoxia-ischemia；cerebral infarction；apoptosis；caspase 3；mice；hypoxic-ischemic encephalopathy

R742

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.008

国家自然科学基金资助项目（81060305）；江西中医药大学课题（2014ZR018）；江西省卫生计生委中医药科研计划项目（2014Z003）；江西省自然科学基金资助项目（20151BAB205068）

1江西中医药大学生理学学科组（邮编330004），2针灸康复科，3解剖学学科组，4实验动物科技中心

肖爱娇（1973），女，副教授，博士，主要从事中医药神经保护作用机制研究