微流控芯片免疫分析抗体固定方法比较

樊斐，张国军，康熙雄，翟燕红

·技术与方法·

微流控芯片免疫分析抗体固定方法比较

樊斐，张国军，康熙雄，翟燕红

化学分析设备微型化领域或微流控分析系统，也称为“微全分析系统（μTAS）或芯片实验室（LOC）”，目前已受到广泛关注［1-2］。20世纪中期，在微流控芯片上建立的一种新型分析平台［3］，目前已被广泛应用在生物研究的各个领域［3］，例如细胞培养［4-5］、单细胞检测［6］、基因分析［7-8］和免疫分析［9-10］。近年来，微流控技术得到广泛应用，尤其是在免疫分析方面，比如对于蛋白质的检测等。但是，在研究中我们发现抗体在微流芯片基底表面的固定是影响微芯片免疫分析的关键因素之一，不仅要求目标蛋白能高效固定，同时要求固定后的目标蛋白能够较好地保持原有的生物活性，能够高效地捕捉靶蛋白。整个实验中，抗体在微芯片载体表面的固定是后续实验完成的基础，决定着实验结果的好坏。因此，本文通过对两种不同的抗体固定方法进行比较研究，分析利弊，以为相关研究者提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

甲胎蛋白（AFP）单克隆抗体、AFP标准品和辣根过氧化物酶（HRP）标记的AFP抗体购自北京科跃中楷生物技术有限公司；HRP化学发光底物液为美国Millipore公司产品；聚二甲基硅氧烷（PDMS）基本组分和固化剂为美国Dow Corning公司产品；磷酸盐缓冲液（PBS）购于北京欣经科生物技术有限公司；牛血清蛋白（BSA）购于德国Merck公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱为上海一恒科学仪器有限公司产品；微流控成像仪为国家科学纳米中心产品；晶芯SmartArrayer-48点样仪为生物芯片北京国家工程研究中心产品。

1.2 方法

1.2.1 微流控芯片的制备本研究中所用的微流芯片为7个通道。先通过机械加工法制作微流通道的模具，然后用模塑法翻模制备微流通道，具体步骤如下：先将PDMS基本组分和固化剂以10∶1的比例混合，真空抽气使浮在表面上的气泡破裂。将抽气后的混合物浇铸在模具上放到80℃烘箱中25 min，冷却后移去固化的PDMS层，再用带针的注射器在PDMS层上打孔以得到通道的进样孔，使用不同尺寸的模具，即可获得相应尺寸的微流通道。

1.2.2 微流控芯片检测AFP根据夹心免疫分析的原理，首先在微通道内加入AFP抗体并固定，然后揭去通道并在与所固定的抗体条带垂直的方向上铺另一个通道，每个通道通入20 μl 3%BSA封闭非特异性位点，接着向每一通道中加入20 μlAFP标准品与基底表面过量的AFP抗体反应，最后一个通道作为空白对照，常温下孵育30 min，那么在两通道交叉的方向上就会形成抗原抗体复合物，通入PBS清洗去除未结合的抗体和抗原。每个通道加入20 μl HRP-AFP抗体，常温下孵育30 min，即形成夹心免疫复合物。清洗之后，去除微流通道并在PDMS基底上反应区域加上化学发光底物，然后放入微流控成像仪检测。因为复合物中酶的含量与样本中AFP含量正相关，所以根据化学发光的强度即可定量测定AFP。

1.2.3 不同尺寸微流通道的比较微流通道的尺寸对微芯片免疫分析的影响是不容忽视的，所以首先需要选择用于微芯片免疫分析最合适的尺寸。我们采用机械加工方法分别制作出高度和宽度皆为100、300、500、800 μm的微流通道模具，再经翻模得到相应尺寸的微流通道。将各尺寸微流通道与PDMS基底紧密贴合，其余实验步骤按方法1.2.2进行，AFP浓度依次为400、200、100、50、25、12.5 ng/ml，最后分析实验结果选出最适合的微流通道尺寸。

1.2.4 基于微流通道固定抗体的试验将得出的最佳尺寸的微流通道固定在PDMS基底上，从进样孔分别加入20 μl浓度为40 μg/ml的AFP抗体，室温孵育30 min后吸出，清洗1次，去除上层微通道，待基底干透后，按方法1.2.2进行抗原检测，检测AFP浓度为50 ng/ml，HRP-AFP抗体以1∶200稀释，其他条件不变。

1.2.5 基于点样法固定抗体的试验将AFP抗体用点样缓冲液稀释到40 μg/ml，取10 μl加入到384孔板中，用晶芯SmartArrayer-48点样仪在PDMS基底表面按照预先设定好的模式进行点样。模式1：用d=120 μm的点样针进行连续点样，同一阵列内各点间距为120 μm，各阵列左右间距为4 mm，上下间距为2 mm；模式2：用d=300 μm的点样针进行单点点样，点间距为2 mm。室温固定30 min后，将基底与微通道黏结后，按方法1.2.2进行抗原检测，AFP浓度依次为400、200、100、50、25、12.5 ng/ml，分别加入到每一通道内进行反应，HRP-AFP抗体以1∶200稀释，其他条件不变。

2 结果

2.1 微流通道尺寸筛选

结果表明，宽度为100 μm微流通道检测结果未见明显信号（图1A）。虽然通过延长曝光时间可见到一些发光点，但亮度极暗，而且曝光时间延长，使发光液显现出来，导致背景值极高，对比度不显著；宽度为300 μm微流通道检测结果信号区域窄，均一性相对较差，而且有些检测点未出现信号（图1B），同时在实验中我们发现，微流通道尺寸过细不仅增加了加样难度，而且容易出现漏液的现象；宽度为500 μm微流通道的检测结果显示，所有阳性点均可检测到发光，信号区域大小适中并且与背景的对比度明显，实验也未出现漏液的现象（图1C）。如果再增加微通道宽度至800 μm，则不仅样品和试剂的消耗量增加，而且还需要增加清洗次数。由此认为，宽度为500 μm的微流通道为最佳选择。

2.2 点样法与微流通道法的比较

虽然点样方法具有批量包被的优势，但是图2结果说明此方法芯片内变异较大，信号均一性较差，信号强度随抗原浓度增高而递增的规律性不明显，而且还需要将微流通道对准所固定的抗体，使得操作复杂。图3说明采用微流通道方法固定抗体变异较小，信号区域大小适中，结果较稳定，更适合用于微流控芯片免疫分析。但是，采用这样的固定方法一次性包被量少，不适合批量进行，因此还需要进一步改善。

图1 四种通道尺寸的标准品化学发光检测成像图片比较（A：100 μm；B：300 μm；C：500 μm；D：800 μm）

图2 基于点样法固定抗体的结果

图3 基于微流通道法固定抗体的结果

3 讨论

微流控芯片在世界范围属于分析技术的前沿，其在疾病诊断领域所具有的优势和应用前景被分析化学科研界以及临床诊断和科学仪器产业界所认可，尤其是在免疫分析方面。尽管微流免疫分析系统在实验室获得了比较好的结果，但要完全产业化还需要更多的努力，还需对芯片制造、表面修饰、抗体的固定、集成检测及免疫化学反应等技术进行组合优化。

近年来人们尝试了各种载体和修饰方法，并对抗体在这些载体上的固定进行了研究，然而迄今为止还没有一种能同时满足不同要求的抗体固定技术。本研究分析了微流通道尺寸对结果的影响，并对AFP抗体在微流控芯片固相载体表面的固定方法进行了优化。理想的抗体固定应具备以下特点：维持抗体结构完整，使其保持与抗原结合的能力；不同批次芯片之间以及同一芯片上各点应整齐均一；非特异性吸附较小、信噪比高；抗体有较长的保质期。从本研究的结果来看，采用微流通道进行抗体固定时，各信号整齐均一，芯片内变异较小，而且非特异性吸附较小、信噪比高，相比点样法更适合用于微流控芯片免疫分析。所以在后续的研究中可以采用微流通道的方法进行抗体固定，但是下一步需要对此方法进行改进，以便于批量包被，这样更有利于产业化，有助于更广泛地应用到蛋白质组学研究、新药开发、医学基础研究和临床诊断等研究领域。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.01.016

100026北京，首都医科大学附属北京妇产医院检验科（樊斐、翟燕红）；100050北京，首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心（张国军、康熙雄）

翟燕红，Email：zhaiyanhong2006@126.com

2014-05-20