Cu2+修饰低固载量固定化漆酶的活性研究*

孙丹丹，宋守欣，王红霞

（功能材料的设计合成与绿色催化黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨师范大学化学化工学院，黑龙江哈尔滨150025）

Cu2+修饰低固载量固定化漆酶的活性研究*

孙丹丹，宋守欣，王红霞

（功能材料的设计合成与绿色催化黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨师范大学化学化工学院，黑龙江哈尔滨150025）

由于漆酶这种生物蛋白酶有容易变性失活且不可重复使用的特性,限制了漆酶的应用和发展。因此如何提高漆酶的活性，稳定性以及重复使用性尤为重要。本文采用交叉偶联技术,将漆酶固定在具有核壳结构的磁性纳米粒子Fe3O4/SiO2上,并研究了用Cu2+修饰后的低固载量固定化漆酶的活性变化以及修饰后固定化漆酶的稳定性。实验结果显示：Cu2+修饰后的低固载量固定化漆酶的相对活性提高了54%；而且在温度不太高的情况下，修饰后的低固载量固定化漆酶的相对活性优于修饰前的固定化漆酶；修饰后的固定化漆酶降解浓度为10mg·L-1的普施安染料，重复利用13次后降解率仍然可以达到92%。

固定化漆酶；铜离子；活性；稳定性

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，它能催化大量的酚类和芳香胺类化合物[1]。游离的漆酶不易回收利用，且稳定性较低，容易变性失活，而酶固定化技术能够实现漆酶的重复使用并改善其稳定性，所以漆酶的固定化研究引起了人们的广泛关注，而固定化漆酶的载体的选择就变得至关重要[2]。由于磁性载体固定化酶在磁场作用下可从反应体系中迅速分离，有利于回收和反复使用、降低成本的特点[3-5]，近年来，用磁性载体在漆酶固定化技术中越来越受到重视。Jun Ge[6]等人发现将含有Cu2+的无机物与有机物混合，通过相互作用形成尺寸不一样大的具有花瓣形状的纳米花，这种含铜的纳米花漆酶与游离漆酶相比催化活性和稳定性都有所提高。本课题组以戊二醛为交联剂，将漆酶稳定固载到氨基修饰的磁性载体Fe3O4/SiO2纳米粒子上，进行固定化漆酶对酚类偶氮染料的降解研究，研究发现，在不使用氧化还原介体的情况下，这种固定化漆酶在1h内对偶氮染料的脱色率达80%以上并且重复利用10次后脱色率仍能达到80%左右[3]。本实验在此基础上，用120mM的Cu2+对以Fe3O4/SiO2为载体的固定化漆酶进行修饰，考察当载体质量为50mg，低固载量时（26mg·g-1）固定化漆酶相对活性的变化，并对修饰后固定化漆酶的稳定性进行研究。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

FeCl2·4H2O；FeCl·36H2O；正硅酸乙酯（TEOS）；异丙醇；漆酶（Sigma-Aldrich）；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APS）；戊二醛（天津市科密欧化学试剂中心）。普施安（PR，Sigma-Aldrich）；HAc。

Lambda45型紫外分光光度计（美国PerkinElmer公司）；JSM-6610型扫描电镜。

1.2 固定化漆酶制备

本实验是取质量为50mg的Fe3O4/SiO2载体溶解在乙醇中，超声10min，加入APS，将两溶液混合在一起，静置40min，将混合物在室温下搅拌12h，反应结束后用蒸馏水洗涤除去未反应的APS。磁性分离后得到氨基修饰的磁性SiO2粒子，标记为Fe3O4/SiO2-NH2。

向处理完的载体中加入2.5%戊二醛，25℃下搅拌3h，得到交联的复合粒子，标记为Fe3O4/SiO2-NH2-GA，用PBS洗涤数遍，然后向载体中加入浓度为0.2mg·mL-1的漆酶溶液，室温搅拌12h,过量的漆酶用磷酸缓冲液洗涤直至用ABTS检测不到残留的漆酶，由此得到固定化漆酶，标记为Fe3O4/SiO2-NH2-GA-E，保存在PBS中，放入4℃的冰箱中，备用。

1.3 固定化漆酶的修饰

将固定化漆酶从冰箱中取出，磁分，将上清液倒入水槽中，加入10mLPBS溶液，取浓度为100，120，140mM的CuSO4溶液各4mL分别加入上述体系中，得到修饰后的固定化漆酶，连续测试6d。

1.4Cu2+修饰后固定化漆酶相对活性的测定

酶活力（enzymeactivity）也称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。反应在25℃下进行，在总反应体积8mL中，含有2mL1mmol ABTS，6mLHAc缓冲液（pH=5.0）。添加到固定化漆酶溶液中启动反应,5min后在波长为420 nm下测定其吸光度值的变化[2,7]相对酶活的计算公式：

R=Ai/Af×100%

式中Ai：固定化漆酶的初始活性；Af：加入Cu2+后固定化漆酶的活性。两者相比，以Ai初始活性为100%则结果就是加入Cu2+后对活性影响的一个相对值变化。

1.5 固定化漆酶修饰前后操作稳定性研究

为考察Cu2+修饰后的固定化漆酶的操作稳定性，本实验取6份相同的固定化漆酶，固载量均为26mg·g-1，3份用120mMCu2+修饰，3份用于对比实验，在最适温度下用于固定化漆酶降解偶氮染料普施安重复利用的平行实验。取修饰前后的固定化漆酶，用PBS溶液洗1～2遍，除去残留的Cu2+，最后将洗液倒掉，取浓度10mg·L-1的普施安染料15mL，15mLPBS溶液加入到固定化漆酶的烧杯中搅拌，每隔20min用紫外分光光度计测量吸光度的变化。

普施安脱色率根据Lambert-Beer定律计算：

式中C0、C、A0、A分别表示PR溶液的初始浓度、脱色后浓度、初始吸光度、脱色后的吸光度。

1.6 固定化漆酶修饰前后热稳定性的研究

载体质量为50mg的固定化漆酶与修饰后的固定化漆酶，测试温度从20℃到70℃。在不同温度下放置30min测定漆酶的吸光度变化值然后根据公式（1.4）来计算固定化漆酶的相对活性，以在室温时的相对活性为100%。

2 结果与讨论

2.1Cu2+修饰后固定化漆酶相对活性的影响

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,对于漆酶来源不同，铜的含量也不同，一般含有4个Cu2+，目前，已证实Cu2+是漆酶的活性部位[8，9]，所以Cu2+的加入是否会对漆酶活性有进一步的提高呢？本实验用不同Cu2+浓度对固定化漆酶进行修饰，然后对其活性进行测试，结果显示固定化漆酶的相对活性有明显提高。

图1 是在漆酶固载量为26mg·g-1时不同Cu2+浓度对固定化漆酶活性的影响。

图1 Cu浓度对固定化漆酶相对活性的影响（Cinitial laccase=0.2mg·mL-1）Fig.1Effect of Cu2+concentration on the relative activity of immobilized laccase

从图1中可以看到，当Cu2+浓度为120mM时对漆酶活性影响最大[6]，相对活性可以达到154%。

2.2 Cu2+修饰后固定化漆酶的稳定性研究

2.2 .1 固定化漆酶的热稳定性研究漆酶是一种蛋白酶，在较高温度时不可避免发生失活行为，漆酶的热稳定性差已经成为限制其在较高温度下发展应用的重要瓶颈，因此，研究漆酶的热稳定性及如何提高漆酶的热稳定性具有极为重要的意义。图2是在不同温度下对修饰前后的固定化漆酶进行热处理，得到不同温度下相对活性的曲线。

图2 温度对Cu2+修饰前后的固定化漆酶相对活性的影响（pH=7.0磷酸缓冲溶液）Fig.2Effect of temperature on the relative activity of the immobilized laccase before and after modification with Cu2+in the phosphate buffer at pH=7.0

从图2中可以看到，25℃时为固定化漆酶的最适温度，将最适温度下的活性定义为100%。而且随着温度的升高，修饰前后的固定化漆酶相对活性都呈现下降的趋势。当温度达到50℃以上时，Cu2+修饰后的固定化漆酶的相对活性下降较快，70℃时的相对活性达到60%左右[10]。而在25～45℃之间，Cu2+修饰后的固定化漆酶的相对活性下降较慢，而且活性高于修饰前活性。由此说明，Cu2+修饰后的固定化漆酶在温度不太高的情况下，能够保持较高的活性。

2.2.2Cu2+修饰后固定化漆酶的操作稳定性研究

图3 Cu2+修饰后固定化漆酶操作稳定性（10mg·L-1PR，pH=7.0 25℃）Fig.3Repeated use of immobilized laccase before and after Cu2+modification for the decoloration of 10mg·L-1of PR solution at 25℃in the phosphate buffer solution

从图3中可以看出，未用Cu2+修饰的固定化漆酶降解第一份10mg·L-1普施安之后，残留浓度最小大概在0.5%左右，随着使用次数的不断增多，10 mg·L-1的普施安的残留浓度逐渐增大，第13个循环时达到14%。而用铜离子修饰后的固定化漆酶在重复使用13次之后，普施安的残留浓度更低，只有8%左右，可见，修饰后的固定化漆酶在经过多次循环使用后，操作稳定性要优于未经Cu2+修饰的固定化漆酶，在第13个循环时降解率仍能达到92%。

2.3Cu2+修饰后固定化漆酶的SEM分析

图4120mM Cu2+修饰固定化漆酶的SEM图，修饰（a）1d（b）3d（c）5dFig.4SEM micrographs of immobilized laccase modified with 120mM Cu2+for（a）1 day（b）3 days and（c）5 days

图4 是120mM Cu2+修饰固定化漆酶SEM照片，（a）为修饰1d的形貌，我们可以看到固定化漆酶成层叠状，一些片状结构隐约可见。修饰3d时，已经初步有花状形成，片状结构越来越多，越紧密，越来越立体。修饰5d时，我们可以清晰的看到纳米花结构的形成。在JunGe[6]的文献中，他们也报道了铜离子修饰后的固定化漆酶呈现纳米花的机构，我们这里的结果和他们一致而且对照修饰后的固定化漆酶活性数据，固定化漆酶是在铜离子修饰5d时活性最高。Jun Ge等人认为相对较高的活性与漆酶这种纳米花结构有关，漆酶的比表面积增大，吸附能力增加，导致漆酶对底物的脱色能力增强[6]。我们推断固定化漆酶活性提高与漆酶的形貌变化有关，但不完全是漆酶形貌变化导致比表面积增加的原因，因为这种染料是无法被游离漆酶降解的，所以单纯的漆酶比表面增加无法使该偶氮染料降解，恰恰是在漆酶固载在Fe3O4/SiO2载体上[3]，才能使这种染料得到快速降解，因此Cu2+的加入很有可能改变或诱导漆酶的活性位发生变化，确切的原因将做进一步的研究。

3 结论

本文对低固载量的固定化漆酶进行Cu2+修饰，实验结果显示：120mMCu2+的修饰低固载量（26mg· g-1）的固定化漆酶，漆酶的活性有明显提高，提高了54%。因此，可以利用这一方法制备低固载量的漆酶，获得较高的活性。修饰后的固定化漆酶的热稳定性及操作稳定性研究结果表明：Cu2+修饰后的固定化漆酶，在温度不太高的情况下，其相对活性优于Cu2+修饰前的固定化漆酶；修饰后的固定化漆酶，降解10mg·L-1的普施安染料，重复利用13次后降解率仍然可以达到92%，稳定性优于Cu2+修饰前的固定化漆酶。

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Research on activity of immobilized laccase with lower laccase loading after Cu2+modification*

SUN Dan-dan，SONG Shou-xin，WANG Hong-xia
（Key Laboratory of Heilongjiang Province for Design and Synthesis of Functional Materials and Green Catalytic,College of Chemistry and Chemical Engineering,Harbin Normal University,Harbin 150025，China）

Laccase is a kind of biological protease,however,the easy denaturation and difficult separation for reuse limit the application and development of laccase.So,how to improve the activity stability of laccase and repeatability is particularly important.In this paper,laccase was immobilized on magnetic Fe3O4/SiO2nanoparticles through cross-coupling method to further investigate the modification of immobilized laccase with lower laccase loading by Cu2+and the corresponding activity as well as the stability of immobilized laccase after modification with Cu2+ions.The results show that the relative activity of the immobilized laccase with lower laccase loading after Cu2+modification increased by 54%,and the relative activity at lower temperature was better than that before modification with Cu2+ions;The modified immobilized laccase can be reused for the degradation of the procion dyes solution with a concentration of 10mg·L-1.,even 13 cycles later,the decolorization percentage is still up to 92%.

immobilized laccase；copper ions；active；stability

Q814.9

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20150314

2015-01-13

黑龙江省自然科学基金（No.B201011）

孙丹丹（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向：催化化学。

导师简介：王红霞（1974-），女，教授，博士，硕士研究生导师，主要从事多孔材料、Fe3O4/SiO2基负载型催化剂的设计、制备及甲烷转化、有机污染物的去除等催化反应的研究。