不同类型烟叶中游离二肽的组成及含量差异分析

何庆，朱栋梁，张晓宇，陈开波,2，田振峰,2

1 安徽中烟工业有限责任公司/烟草化学安徽省重点实验室，合肥 230088;2 安徽中烟-中科大烟草化学联合实验室，合肥 230088

烟草与烟气化学

不同类型烟叶中游离二肽的组成及含量差异分析

何庆1，朱栋梁1，张晓宇1，陈开波1,2，田振峰1,2

1 安徽中烟工业有限责任公司/烟草化学安徽省重点实验室，合肥 230088;2 安徽中烟-中科大烟草化学联合实验室，合肥 230088

为比较不同类型烟叶中游离二肽的组成以及含量的差异，利用甲醇/三氟乙酸溶液提取，Fmoc衍生化-液质联用分析烟叶中的游离二肽。结果显示：1）通过对二肽在质谱中断裂模式的探讨，共鉴定出烤烟烟叶中14种、白肋烟中11种、香料烟中9种游离二肽。游离二肽的含量范围为1μg/g-120μg/g。2）不同类型烟叶在二肽种类上有一定程度的差异，谷氨酰胺（赖氨酸）-苯丙氨酸（KF/QF）以及双丙氨肽（AA）是三种类型烟叶中共有的含量较大组分，烤烟中脯氨酰缬氨酸（PV）以及甘氨酰谷氨酰胺(赖氨酸)（GQ/GK）含量较高，白肋烟中天冬氨酰组氨酸（DH）含量较高，而香料烟中缬氨酰苯丙氨酸（VF/FV）以及谷氨酰谷氨酰胺（赖氨酸）（EK/KE）这两种二肽含量较高。

烟草；肽；LC-MS

肽广泛存在于食品和蛋白酶解物中，而且被认为是美拉德反应中重要的风味增香剂和前体物。小分子肽与还原糖发生的美拉德反应会产生大量香味成分，其中有些香味成分是肽类物质美拉德反应所特有的。新鲜烟叶通常含有较大量的蛋白质[1]，烟叶在调制、复烤和醇化过程中，蛋白质在蛋白酶的作用下不断分解和转化，降解为游离氨基酸和低分子肽[2]。其中游离氨基酸和二肽作为美拉德反应底物，具有较强的反应活性。烟草游离氨基酸分离鉴定已经比较成熟，但是对于烟草游离二肽的鉴定未见报道。

近年来，液质联用技术（LC-ESI/MS）被广泛应用于多肽分子量及氨基酸序列的测定[3]，它大大简化了前处理的步骤。然而，对于短链肽（Mr=50-400）来说，由于其弱离子化效率以及强基线干扰，增大了检测难度，常用的液质联用方法往往检测效果不理想。Ca´rdenas等[4]利用琥珀酰亚胺基-2-(3-吡啶)-乙酯（SPA）在pH=7的缓冲溶液中与肽在线衍生化后进行HPLC-MS分析，结果表明，衍生化后的短链肽（7-15肽链）离子化能力有明显增强，大大提高了其灵敏度（飞摩尔级），然而此衍生化试剂SPA在水溶液中极不稳定，对操作要求较高，且无商品化产品，需要实验室合成。Karin Gartenmann等[5]改进了衍生化试剂，利用氨基保护试剂氯甲酸9-芴基甲酯（Fmoc）对多肽衍生化，简便了操作步骤且提高了分析速度。

本研究拟采用FMOC衍生化方法，通过液质联用技术（LC-ESI/MS）对烟草中的二肽进行鉴定，并比较烤烟烟叶、白肋烟烟叶和香料烟烟叶中二肽种类及含量的差异，以期对香味风格研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

分别选取2012年四川凉山烤烟云烟87、四川达州白肋烟达白1号和四川攀枝花香料烟三种不同类型调制后的烟叶进行游离二肽分析，烟叶部位均为上二棚，等级均为B2F。各类型烟草栽培调制措施均按当地的生产技术规范进行。各烟叶于40℃干燥后研磨并过40目筛，备用。

甲醇、乙腈（色谱纯，TEDIA）；0.1M硼酸盐缓冲液（pH 10.4）、三氟乙酸（分析纯，国药）、丙酮、正戊烷、乙酸乙酯，氯甲酸9-芴基甲酯（Fmoc-Cl，分析纯，Sigma公司）。双丙氨肽（AA）标样（Sigma公司）。

4000 Q Trap质谱仪（美国AB公司）；Waters Acquity超高压液相色谱仪（UPLC，美国Waters公司）；Milli-Q 超纯水仪（美国Millipore公司）；VX-200漩涡混合仪（美国Labnet公司）；2-16K高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；AL204-IC电子天平（0.1mg，梅特勒-托利多公司）。

1.2 双丙氨肽（AA）标样处理与分析

准确称取10 mg双丙氨肽标样于100 mL容量瓶中，以100 mL硼酸盐缓冲液（0.1M，pH=10.4）溶解，定容，得到100 μg/mL双丙氨肽标准溶液。

准确量取1mL、5mL、10mL、50mL上述双丙氨肽标准溶液于100mL容量瓶中，以100mL硼酸盐缓冲液（0.1M，pH=10.4）溶解，最终分别得到1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL 和 100μg/mL的双丙氨肽系列标准溶液。

参照文献[3,6]方法，取500μL双丙氨肽系列标准溶液于试管中，加入Fmoc-Cl衍生化试剂（500μL，5.8mM于丙酮中），剧烈搅拌反应，反应产物分别用2mL正戊烷/乙酸乙酯=80/20的溶剂萃取2次，合并水相进行LC/MS分析。测定条件为：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C-18柱（2.1 mm × 50 mm, 1.7μm）；柱温：25℃；流动相：0.045%TFA/水溶液（A），0.05% TFA/80%乙腈水溶液（B）；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱：95%A+5%B（0～2 min），40%A+60%B（2～10 min），0%A（10～15 min），0%A（15～19 min），95%A+5%B（19～20 min）；进样量：10μL。

电离模式：电喷雾（ESI）正离子模式；电喷雾电压：5500 V；检测模式：全扫描；离子源温度：500 ℃；Curtain Gas 50psi；Gas1 30psi；DP 30V；EP 5V；扫描时间：1s。

1.3 样品处理与分析

称取烟末约1g于25mL试管中，加入10 mL提取剂（30%甲醇/0.1%三氟乙酸），漩涡混合1 min后，在4℃下以15000 rpm离心15min。小心取出上层清液，通过0.22 μm滤膜，氮气吹干，固形物使用2mL 5%乙酸铵溶液溶解，溶解液通过0.22 μm滤膜后保存于-18℃冰箱中备用。

将上述样品溶液100 μL加入400 μL硼酸盐缓冲液（0.1M，pH=10.4）中，然后再加入Fmoc-Cl衍生化试剂（500 μL，5.8 mM于丙酮中），剧烈搅拌反应。反应产物分别用2mL正戊烷/乙酸乙酯=80/20的溶剂萃取2次，合并水相进行LC/MS分析。测定条件同1.2。

2 结果与讨论

2.1 烟叶中二肽的鉴定

HPLC及HPLC/MS常用于生物小分子肽的检测[7-8]，为了提高小肽的稳定性以及响应，特别是提高其在LC-MS中的离子化效率，常利用FMOC衍生化的前处理办法[3,9-10]。然而，由于二肽标样种类繁多，且大部分难以获得，给定性定量带来很大的困难。本研究根据Fmoc衍生肽的断裂模式来鉴定烟草中的潜在游离二肽。Fmoc衍生二肽在MS/MS中的断裂模式如图1所示，主要断裂如下：与Fmoc芳香部分的丢失相应所产生的碎片离子m/z 179.2±0.1，m/z179的丢失产生了二肽质量加上与Fmoc中O-C=O部分相应的44的离子。所观察到得其他断裂是C-末端氨基酸的丢失，产生与N-末端氨基酸加上44质量单位相应的分子离子，由此揭示二肽的氨基酸序列。另外，同时发生的44质量单位的丢失产生了二肽的分子离子，对于因为Lys或Tyr（分子中含两个氨基或羟基）残基的存在而携带附加Fmoc部分的肽而言，进行了类似的断裂模式观察。

图1 MS/MS中Fmoc衍生肽的断裂模式Fig. 1 Fragmentation pattern of Fmoc-derivatized peptides in MS/MS analysis

以烤烟样品质谱图为例（图2）,从Fmoc衍生二肽的LC-MS总离子流图（图2a）上可以得到每个时间段的离子图，全部未知质量减去由Fmoc基团引起的质量单位222后，即为可能的二肽分子离子质量。样品在7.86min的主要分子离子为m/z383.2（图2b），对应二肽质量数则为160.2。可能的二肽包括Ala-Ala、Gly-GABA以及GABA-Gly。对此分子离子进行诱导断裂，通过调节碰撞电压，可以发现，主要的碎片离子为m/z 311.3（图2c），这是Fmoc-氨基酸碎片离子，可以判断与Fmoc端相连的氨基酸分子质量为89，最有可能的即为丙氨酸Ala，由此可判断7.86min的二肽为Ala-Ala二肽。经与标样色谱图及碎片离子比照，证实该峰为双丙氨肽峰。

图2 某烤烟样品的总离子流图（a）、母离子（b）和子离子（c）扫描图Fig. 2 TIC chromatogram (a), parent (b) and product (c) ions of fl ue-cured tobacco sample by LC/MS

2.2 三种类型烟叶中二肽的组成及含量差异

根据Fmoc衍生肽的断裂模式，分别对三种不同类型烟叶中的游离二肽进行了鉴定，结果见表1-表3。实验共鉴定出烤烟烟叶中14种二肽（表1），白肋烟烟叶中11种二肽（表2）以及香料烟烟叶中的9种二肽（表3）。但对于同量异序氨基酸，例如由Gln和Lys以及Ile和Leu组成的二肽，不能够实现N-或C-末端氨基酸清楚的鉴定。从表中可以看出，三种类型烟叶在二肽种类上既有相同组分，也存在着一定程度的差异。

试验比较了不同类型烟叶游离二肽含量的差异，其中双丙氨肽采用标准曲线外标法定量，其他二肽采用与双丙氨肽峰面积相对定量的方式。可以看出，烟叶中不同二肽含量范围在1μg/g-120μg/g之间，谷氨酰胺（赖氨酸）-苯丙氨酸（KF/QF）以及双丙氨肽（AA）在三种类型烟叶中均含量较大，烤烟中脯氨酰缬氨酸（PV）以及甘氨酰谷氨酰胺(赖氨酸)（GQ/GK）含量较高，白肋烟中天冬氨酰组氨酸（DH）含量较高，而香料烟中缬氨酰苯丙氨酸（VF/FV）以及谷氨酰谷氨酰胺（赖氨酸）（EK/KE）这两种二肽含量较高。

研究表明[11]，白肋烟、马里兰烟、晒烟中含量最高的氨基酸为天门冬氨酸和谷氨酸，而烤烟和香料烟含量最高为脯氨酸和谷氨酸。不同类型烟草氨基酸含量在含量组成中脯氨酸、天门冬氨酸变异度最大。可以看出，不同类型烟叶中游离二肽的的组成及含量与氨基酸的差异是相一致的。

按照二肽在调制过程中对味觉影响[12]分类，烤烟中含量较高的脯氨酰缬氨酸（PV），其反应香料具有愉悦的烘烤和面包气息，白肋烟中含量较高的天冬氨酰组氨酸（DH），其反应香料具有强烈的焦糖气息，并伴有辛辣味；而香料烟中含量较高的谷氨酰谷氨酰胺（赖氨酸）（EK/KE），其反应香料具有明显的坚果和巧克力气息，可以推测，以脯氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸为氨源的二肽对于不同类型烟草表现的内在质量有着一定影响。

表1 某烤烟烟叶中游离二肽的组成及含量Tab.1 Identi fi cation and characterization of dipeptides in fl ue-cured tobacco

表2 某白肋烟烟叶中游离二肽的组成及含量Tab.2 Identi fi cation and characterization of dipeptides in burley tobacco

表3 某香料烟烟叶中游离二肽的组成及含量Tab.3 Identi fi cation and characterization of dipeptides in oriental tobacco

由于目前国内外对于烟草中肽的研究较少，不同类型的二肽对于烟草香气、吃味等品质的影响尚没有明确的结论。但通过对烟草中二肽组成和含量的分析,能够进一步了解烟草品质与内在化学成分的关系，特别是对于小分子肽在调制、储存以及燃吸过程中的反应变化和香味贡献研究，有一定的帮助。进一步地，可以按照烟草内源二肽组成，有的放矢地进行二肽反应香料研究，为烟草加香提供一种新的思路。

3 结论

（1）鉴定出烤烟烟叶中14种二肽，白肋烟烟叶中11种二肽以及香料烟中9种二肽。其在烟叶中的含量范围为1μg/g-120μg/g。

（2）谷氨酰胺（赖氨酸）-苯丙氨酸（KF/QF）以及双丙氨肽（AA）是三种类型烟叶中共有的含量较大组分，烤烟中脯氨酰缬氨酸（PV）以及甘氨酰谷氨酰胺(赖氨酸)（GQ/GK）含量较高，白肋烟中天冬氨酰组氨酸（DH）含量较高，而香料烟中缬氨酰苯丙氨酸（VF/FV）以及谷氨酰谷氨酰胺（赖氨酸）（EK/KE）这两种二肽含量较高。

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Difference in composition and content of free dipeptides among various tobacco types

HE Qing1, ZHU Dongliang1, ZHANG Xiaoyu1, CHEN Kaibo1,2, TIAN Zhenfeng1,2
1 China Tobacco Anhui Industrial CO., LTD，Anhui Provincial Key Laboratory of Tobacco Chemistry, Hefei 230088, China；2 CTAH-USTC Associated Laboratory, Hefei 230088, China

In order to compare the differences in composition and content of free dipeptides among various tobacco types, free dipeptides in tobacco leaves were separated and analyzed by liquid chromatography coupled with mass spectrometry after methanol/TFA extraction and Fmoc derivatation. Test results showed that (1) 14 dipeptides in fl ue-cured tobacco, 11 in burley tobacco and 9 in oriental tobacco were identi fi ed through fragmentation mechanism discussion. Dipeptides content in tobacco was among 1μg/g-120μg/g. (2) Dipeptides of KF/QF and AA had high concentration in all tobacco types. Flue-cured tobacco samples had high dipeptides of PV and GQ/GK while burley samples were high in DH and oriental tobacco was high in VF/FV and EK/KE.

tobacco; peptides; LC-MS

何庆，朱栋梁，张晓宇,等. 不同类型烟叶中游离二肽的组成及含量差异分析[J]. 中国烟草学报，2015,21（4）

安徽中烟工业有限责任公司科技项目（20121001）

何庆（1986—），工程师，硕士，主要从事烟草及香料化学研究，Tel: 0551-65738672，Email: qing_he0421@163.com

田振峰（1975—），工程师，硕士，主要从事烟草及香料化学研究，Tel：0551-65738652，Email：Tianzfeng@sohu.com

2014-10-09

:HE Qing, ZHU Dongliang, ZHANG Xiaoyu, et al. Difference in composition and content of free dipeptides among various tobacco types [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(4)