血清高尔基体蛋白73联合甲胎蛋白检测在原发性肝癌患者中的诊断价值

崔冉亮 李悦国 张鹏宇 张鹏

·临床研究与应用·

血清高尔基体蛋白73联合甲胎蛋白检测在原发性肝癌患者中的诊断价值

崔冉亮 李悦国 张鹏宇 张鹏

目的：探讨高尔基体蛋白73（golgi protein 73，GP73）联合甲胎蛋白检测用于原发性肝癌诊断的临床意义。方法：收集2013年6月至9月天津医科大学肿瘤医院160例血清，其中原发性肝癌患者46例，单纯肝硬化患者30例，其他消化系统肿瘤患者44例，健康者40例。应用酶联免疫吸附实验定量检测血清GP73水平，电化学发光免疫分析检测血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平。结果：GP73诊断原发性肝癌的敏感性达到73.9%，与本研究中AFP敏感性（56.5%）相比，前者有显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。GP73和AFP联合检测敏感性有显著提高，可以达到86.9%，与单独一种相比敏感性有显著性差异（P＜0.01）。结论：GP73有可能作为原发性肝癌诊断的血清标志物之一，而GP73和AFP的联合检测对原发性肝癌的诊断也有较好的应用价值。

肿瘤标志物 GP73 甲胎蛋白 肝细胞癌

原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）恶性程度高、进展快、预后差、侵袭性强，是我国常见的恶性肿瘤之一，已成为一个世界性难题，其发病率在全球位居第4位，总患者数约56.4万［1］。但是原发性肝癌的发病比较隐匿，初期患者无明显症状，但当就诊症状明显时，可能已经发展至原发性肝癌的晚期，所以在治疗上成为一个很大的难题，导致5年生存率低、治愈率不高的不良后果。

在过去相当长的时间里，甲胎蛋白（AFP）是唯一被推荐用于原发性肝癌监测的血清标志物［2-4］。回顾性分析认为，AFP作为早期原发性肝癌监测工具，敏感度为39%～64%，特异度为76%～91%，阳性预测值为9%～32%［5-7］，因此其作为早期诊断的手段并不理想；另外，肝脏超声用于临床研究中原发性肝癌诊

断时，通常难以发现、确认＜3 cm的肿块，而且肝脏超声受到操作者影响，限制其应用价值，从而不能作为一种监测性检验方法［8-9］。因此，临床上迫切需要找到一种更加灵敏的血清肿瘤标志物应用在检测原发性肝癌。在新近的报道中发现，在原发性肝癌患者血清中，GP73水平显著提高，而且对于原发性肝癌的诊断，GP73也比AFP出现更早［10］。本研究主要评估血清GP73和AFP联合检测对于原发性肝癌诊断的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1材料

收集2013年6月至9月间在天津医科大学肿瘤医院就诊的160例血清，其中原发性肝癌患者46例，单纯肝硬化患者30例，其他消化系统肿瘤患者44例（胃癌23例，结直肠癌21例），其中男性59例，女性61例；年龄35～75岁，平均年龄为55岁。均经本院病理科病理学检测确诊，在此基础上分别检测了每例患者的GP73以及AFP含量。选取40例健康者为正常对照，入选者无肝、脑、心、肾等主要脏器疾病，年龄32～68岁，平均年龄50岁。

1.2方法

1.2.1标本采集采用带有分离胶的进口真空采血管取患者空腹静脉血4 mL，离心力3 000 rpm，离心5 min取血清待测。

1.2.2检测方法甲胎蛋白（AFP）的测定：采用Roche E170电化学发光免疫分析仪及配套试剂盒（瑞士Roche公司）检测血清AFP浓度，操作严格按照仪器和试剂说明书进行，并且高低质控品均在要求范围内。参考值为20 ng/mL，当患者血清水平超出临界值时判定为阳性。

高尔基体蛋白73（GP73）的测定：GP73检测所用试剂盒由北京热景公司提供，采用双抗体夹心ELISA法检测血清GP73的浓度。试剂盒内设GP73标准品0、20、50、100、250 ng/mL。酶标板上预包被抗GP73单抗，与样本中GP73反应结合，再加入HRP标记GP73多抗，用TMB底物显色，显色浓度与样品中GP73的浓度呈正比。通过酶标仪检测样本的吸光度（A）值，按已知GP73标准品，计算出样品中GP73的含量。操作严格按照规程，结果按说明书规定＞100 ng/mL为阳性。试剂线性为0～250 ng/mL。对＞250 ng/mL的样本，使用配套稀释液手工稀释后再检测。

1.3统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据处理。组内GP73以及AFP比较用t检验，不同组间GP73以及AFP比较予以单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1GP73与原发性肝癌临床因素的相关性

从表1中可以看出，原发性肝癌患者血清GP73的表达水平与性别、年龄、甲胎蛋白浓度、肿瘤直径、结节数目、TNM分期均无关，各组比较均无统计学差异（P＞0.05）；与是否合并肝硬化有关，两组差异有统计学意义。GP73在肝硬化和肝癌病变细胞中表达属同向协同作用，也有相关文献显示P73在肝硬化中表达上调，但其升高程度远不及原发性肝癌［8］。所以，可将GP73作为预测原发性肝癌的检测指标。

表1 GP73在原发性肝癌的临床指标Table 1Expression of GP73 in primary hepatocellular carcinoma of different clinical characteristics

2.2GP73和AFP检测阳性率结果

各组人群GP73和AFP检测阳性率结果见表2。本研究阳性率指敏感性，即患者中得出阳性检测的样本占患者总数的百分比。诊断原发性肝癌GP73的敏感性达73.9%，与本研究中AFP敏感性（56.5%）相比，前者有显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。而在单纯肝硬化组和其他消化系统肿瘤（主要是指胃癌和结直肠癌）组中，GP73和AFP检测阳性率分别为36.7%、6.8%和43.3%、9.1%，说明GP73对于肝癌的诊断有特异性，而对于单纯肝硬化和其他消化系统肿瘤则意义不明显。健康人群中GP73和AFP敏感性均为0，综上说明GP73与过去唯一推荐原发性

肝癌检测指标（AFP）一样，可以作为原发性肝癌的诊断指标之一。

表2 各组人群GP73和AFP检测敏感性（阳性率）Table 2Sensitivity of GP73 and AFP in different groups

2.3原发性肝癌患者中GP73和AFP的ROC曲线

绘制ROC曲线，确定最佳临界值，并鉴定GP73和AFP在区分HCC患者的敏感度和特异度。GP73的ROC曲线下面积（AUROC）为0.849（95%CI：0.719～0.980），敏感度为74%，特异度为73%；而AFP的AUROC为0.732（95%CI：0.575～0.890），敏感度为57%，特异度为98%；GP73的曲线下面积（AUROC）大于AFP。通过比较两者的ROC曲线，发现GP73明显优于AFP（图1）。

图1 PHC中GP73和AFP的ROC曲线分析Figure 1ROC curve of the GP73 and AFP in PHC

2.4GP73和AFP联合检测阳性率结果

单纯肝硬化GP73和AFP联合检测仅为53.3%，GP73和AFP联合检测敏感性有显著提高，可以达到86.9%，与单独一种相比敏感性有显著提高，差异有统计学意义（P＜0.01）。计算各组约登指数原发性肝癌组、单纯肝硬化组和其他消化肿瘤组分别为0.764、0.318和-0.004，指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大，所以将GP73和AFP联合用于原发性肝癌的检测更能提高检出率。各组人群GP73和AFP联合检测阳性率结果见表3。

表3 各组人群GP73和AFP联合检测阳性率Table 3Positive rate of GP73 and AFP in different groups

3 讨论

AFP是原发性肝癌的重要标志物，现已广泛应用于临床，然而有相当一部分原发性肝癌患者的AFP检测结果呈阴性。有报道约30%肝细胞癌患者AFP不升高，其原因可能是此类肿瘤细胞分化程度接近正常或者坏死程度严重，这些高危人群癌组织中产生大量结缔组织，这样AFP合成的含量减少［11］。

不仅高分化或分化很差的肝癌细胞往往不产生AFP使得原发性肝癌的诊断呈假阴性，其他一些疾病也可能引起甲胎蛋白的升高，特别是慢性肝炎以及肝硬化［9］，这样致使原发性肝癌假阳性概率也增高。另外影像学检查局限性很多，如肝脏超声用于早期原发性肝癌患者诊断时，通常未能及时准确诊断，这样使得患者错过了最佳的治疗时机。因此，临床期待一种更好的血清标志物进行有价值的肝癌诊断。

近年来蛋白组学的飞速发展使得一些新型肿瘤标志物的发现成为可能［12］。有报道介绍一种新的高尔基体跨膜糖蛋白GP73，指出这种蛋白的上调和原发性肝癌有着密切关系［13］。之后有关GP73的研究报道不断出现。高尔基体糖蛋白73（GP73）是一种高尔基体Ⅱ型跨膜蛋白，在多种组织的内皮细胞中表达。通常在正常的肝脏组织内GP73很少出现表达，主要在胆管上皮细胞中表达［14］。但在肝脏癌变状态下，GP73在肝细胞中表达显著上调，外周血中含量显著上升［15-16］。因此本研究主要采用手术或病理确诊的肝细胞癌患者，并且系原发肿瘤非转移患者。

本研究应用双抗体夹心ELISA的方法检测血清中GP73的浓度，检测方法简单快速，便于操作，标准曲线线性关系良好，质控接近靶值，所得结果较为可靠。原发性肝癌组临床资料显示GP73的表达结果与性别、年龄、肝脏肿瘤组织的大小、分化程度、临床分期及血清AFP水平无关联，仅与有无肝硬化相关，可能由于合并肝硬化的肝癌患者肝细胞直接损伤更加严重，而GP73可能同肝细胞损伤直接相关，这也是初期发现GP73所提示的意义所在。因此，这类患者癌周不典型增生的癌细胞较多，而引起GP73在发生病

变的肝细胞中表达上调所致。但是研究病例较少，需要进行大样本确证性试验。

本研究收集了一些非肝脏疾病的其他消化系统肿瘤患者，主要为胃癌和结直肠癌，发现其GP73水平同正常人无明显区别，可作为共同对照组，这同时也表明了GP73升高有肝细胞特异性，可能同非肝脏的其他消化系统疾病无直接关联。

根据ROC曲线可见，GP73诊断PHC的敏感性达到73.9%，与本研究中AFP敏感性（56.5%）相比，前者有显著增高，而曲线下面积显示，GP73的性能明显优于AFP。46例原发性肝癌患者中20例GP73阳性，而AFP阴性的20例原发性肝癌患者中，GP73表达阳性例数达14例，这表明AFP处于正常水平，或者是AFP低水平的某些原发性肝癌患者，AFP检测可能影响治疗评估和监测，而用GP73进行诊断是有价值的。两者联合检测的敏感度提高至86.9%，而特异度保持在较高水平（89.5%），这样也大幅降低了AFP阴性病例的漏检率。因此，在未找到新的肝癌标志物前，GP73具有良好的临床应用价值，有望成为肝癌的诊断标志物。

研究表明GP73升高可能与原发性肝癌发生时小胆管上皮细胞的破坏或内皮细胞增殖有关［17］，但是本研究大部分采用手术或病理确诊的肝细胞癌，胆管细胞癌例数较少；有研究指出GP73水平升高是由于HBV感染导致［15］，而有研究则认为并非此病毒感染引起［18］及GP73的升高是否与肝硬化直接相关；另外本研究验证方法不多，今后的研究不仅包括临床病例，还需要增加更多包括分子PCR或者蛋白免疫印迹等检测方法，关于GP73的临床应用价值需要进一步探讨。

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（2014-08-20收稿）

（2014-10-05修回）

（编辑：周晓颖）

Combined detection of alpha-fetoprotein and Golgi protein 73 for primary hepatic carcinoma diagnosis

Ranliang CUI,Yueguo LI,Pengyu ZHANG,Peng ZHANG

Peng ZHANG;E-mail:laopang.56@163.com

Objective:The diagnostic sensitivity of alpha-fetoprotein(AFP)in patients with primary liver cancer is poor and unsatisfactory in the clinical diagnosis of patients with primary liver cancer.Recent studies have demonstrated the upregulation of serum primary hepatic carcinoma(PHC)and Golgi glycoprotein 73(GP73)in patients with PHC.This study aims to discuss the clinical significance of GP73 and AFP in the serum on the diagnosis of primary liver cancer.Methods:The serum concentrations of GP73 and AFP were retrospectively analyzed in 46 hepatocellular carcinoma patients,30 cases of patients with liver cirrhosis alone,44 patients with other digestive tumors,and 40 healthy subjects as controls.Quantitative euzymelinked immunosorbent assay and electrochemiluminescence immunoassay were conducted to determine the GP73 and AFP levels in the serum,respectively.Results:The sensitivity of PHC diagnosis significantly increased with GP73(73.9%)compared with AFP(56.5%),and the difference was statistically significant(P< 0.01).The sensitivity of AFP combined with GP73 significantly improved to 86.9%compared with the sensitivity of a single indicator (P<0.01).Conclusion:GP73 may be used as one of the PHC serum markers for diagnosis.The combined detection of GP73 and AFP offers great potential for future application in the diagnosis of PHC.

tumor marker,Golgi protein 73,alpha-fetoprotein,hepatocellular carcinoma

10.3969/j.issn.1000-8179.20140757

天津医科大学肿瘤医院检验科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，国家“863”计划临床研究实验室（天津市300060）

张鹏laopang.56@163.com

Department of Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,National"863"Plan Clinical Research Laboratory,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin300060,China

崔冉亮专业方向为肿瘤标志物检测。

E-mail：cuiranliang@163.com