副猪嗜血杆菌山东分离株的鉴定及药敏试验

李天芝，于新友，王 艳，苗立中，沈志强，

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

副猪嗜血杆菌(Hps)可引起猪以纤维素性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为特征的传染病[1-3]。早在1910 年，德国科学家Glasser 首次报告了Hps 引起的猪纤维素性浆膜炎和多发性关节炎[4]。随着世界养猪业的发展，该病发病率逐年上升，已成为一个全球性的重要猪病[5]，给养猪业带来重大经济损失，严重威胁着全世界养猪业的健康发展[6]。近年来，我国各主要养猪省份均有该病的相关报道。2014 年4 月份，山东省某猪场15%断奶仔猪陆续出现各种临床症状，如精神沉郁、食欲减退、呼吸困难、咳嗽，腹式呼吸，皮肤黏膜发绀，关节肿胀、跛行等。发病猪死亡率为30%，病死猪经剖检发现肺与胸壁粘连，心外膜与心肌粘连，呈现“绒毛心”外观，心包积水，腹腔内有淡黄色污浊的液体，肝脏与腹壁粘连，关节腔内有浆液性淡黄色渗出物，关节周围皮下组织与肌腱水肿。笔者无菌操作取病猪的心血、心包积液、关节液进行分离鉴定，成功分离到1 株副猪嗜血杆菌。

1 材料与方法

1.1 病料、试剂和实验动物

病料为采自山东省某猪场的疑似副猪嗜血杆菌感染猪心血、心包积液、关节液。金黄色葡萄球菌、草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、石炭酸复红染液由本试验室提供，生化试验用各种试剂、药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司，DL2000 Marker、TagDNA 聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司，胰蛋白大豆琼脂（TSA）、胰蛋白大豆肉汤（TSB）培养基购自青岛海博生物技术有限公司，NAD、基因组DNA 小量抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。20 只16～20 g Balb/c小鼠购自山东省实验动物中心。

1.2 引物设计与合成

参照GenBank 登录的副猪嗜血杆菌16SrRNA 基因（GU226401），设计1 对引物，引物序为F：5'-AGTATC GGGAGATGAAAGAC-3'；R：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT -3'，扩增片段长度为1 083 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 细菌分离、培养

将采集的猪心血划线接种于含NAD 的TSA 平 板，37 ℃培 养24 h，对可疑菌落进行涂片，革兰氏染色镜检。

1.4 卫星现象

挑取分离菌分别划线于2 个鲜血琼脂平板上，在其中一个培养基中央作2条平行划线状接种金黄色葡萄球菌，于5% CO2环境37 ℃培养48 h，观察生长结果。

1.5 因子依赖试验

将分离菌接种于同时添加了NAD和小牛血清的TSA 平板和只添加小牛血清的TSA 平板，于5% CO2环境37 ℃培养48 h，检查其生长特性及对V 因子的依赖性。

1.6 生化鉴定

将分离菌用含NAD 和小牛血清的TSA 平板48 h 纯培养后，进行糖发酵试验及其他生化试验。

1.7 PCR 鉴定

挑取含NAD 的TSA 平板上单个菌落，接种于含5%小牛血清和NAD 的TSB 培养基中，37 ℃ 200 r/min，培养24 h，用基因组DNA 小量抽提试剂盒提取分离菌DNA 作模板，进行PCR 扩增。反应体系如下：10×Buffer 25μL，引 物F 和R 各2.5μL（15 pmol/L）。dNTP 5μL，TagDNA 聚合酶0.5μL，模板2μL，加水补足至50μL。扩增反应程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃10 min。PCR 产物回 收后，与pMD18-T 载体连接，转化DH5α，将初步鉴定为阳性的重组菌送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.8 Balb/c 小鼠致病性试验

20 只Balb/c 小 鼠， 随 机 分2组，每组10 只。无菌吸取上述经生化鉴定的分离菌培养物分别腹腔注射10 只试验组Balb/c 小鼠，每只注射0.5 mL(6×109CFU/mL)，10 只 对 照分别腹腔注射0.5 mL TSB 培养基作对照。注射后Balb/c 小鼠隔离饲养，观察发病及死亡情况。并取死亡Balb/c小鼠的心血进行细菌分离。

1.9 药敏试验

采用纸片琼脂扩散法将所分离的副猪嗜血杆菌24 h TSB 纯培养物10 倍稀释后，接种于含NAD 的TSA 平板上，每个平板接种0.2 mL，并将其涂布均匀。然后用无菌镊子将各种药敏片分别平放在培养基表面，保持纸片间适度距离，37 ℃温箱48 h。观察结果并测量抑菌圈直径。

2 结果

2.1 细菌分离培养结果

在TSA 固体培养基平板上37 ℃培养24 h 后，形成表面光滑、湿润、圆形、无色透明，直径为1～2 mm 的菌落。挑取单个菌落涂片进行革兰氏染色，镜检为短杆状的革兰氏阴性菌。

2.2 卫星现象

在金黄色葡萄球菌两侧可见有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，离金黄色葡萄球菌愈近菌落生长越好，愈远菌落越小，呈现出明显的“卫星现象”，而在未接种金黄色葡萄球菌的平板则不见细菌生长。

表1 副猪嗜血杆菌滨州株分离株生化反应结果

2.3 V 因子依赖试验结果

在未添加NAD 的TSA 平板未见细菌生长，而在添加NAD 的TSA 平板上生长良好，说明其生长依赖V 因子。

2.4 生化试验结果

由表1 可知，分离的副猪嗜血杆菌生化结果为依赖NAD、不出现溶血现象、接触酶试验反应阳性，硝酸盐还原试验阳性，氧化酶、脲酶、吲哚试验、V-P试验均呈阴性。能发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、山梨糖、半乳糖、核糖、蔗糖、海藻糖，不能发酵甘露糖、木糖、蜜二糖、棉子糖、阿拉伯糖、乳糖、山梨醇、甘露醇。

2.5 PCR 鉴定

PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小为1 083 bp，与预期结果一致（图1）。

图1 副猪嗜血杆菌滨州株分离株PCR检测结果

扩增产物测序结果如下：

AGTATCGGGAGATGAAAGACTGG GACCGCAAGGCCAGTTGCCATAAGAT GAGCCCAAGTGGGATTAGGTAGTTGG TGGGGTAAAGGCCTACCAAGCCGACG ATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGAC CAGCCACACTGGAACTGAGACACGGT CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG GGGAATATTGCACAATGGGGGGAACC CTGATGCAGCCATGCCGCGTGAATGA AGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCT TTCGGTGATGAGGAAGGGTGGTGTTT TAATAGAACATTACATTGACGTTAGT CACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCG TGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGG GTGCGAGCGTTAATCGGAATGACTGG GCGTAAAGGGCACGCAGGCGGTGACT TAAGTGAGATGTGAAAGCCCCGAGCT TAACTTGGGAATTGCATTTCATACTG GGTTGCTAGAGTATTTTAGGGAGGGG TAGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAAT GCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGAA GGCGAAGGCAGCCCCTTGGGAAAATA CTGACGCTCATGTGCGAAAGCGTGGG GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT AGTCCACGCTGTAAACGCTGTCGATT TGGGGATTGGGCTTAGAGCTTGGTGCC CGTAGCTAACGTGATAAATCGACCGC CTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAA ACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT TCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCT ACTCTTGACATCCTAAGAAGAACTCA GAGATGAGTTTGTGCCTTCGGGAACT TAGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCG TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTA TCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGG AACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAA ACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCA AGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGG CTACACACGTGCTACAATGGTGCATA CAGAGGGTGACGAAGCC

将测序结果与参照的GenBank 登录的副猪嗜血杆菌16SrRNA 基因的相似性为100%。

2.6 Balb/c 小鼠致病性试验结果

分离菌的TSB 纯培养物注射试验组的Balb/c 小鼠24 h 后，均表现精神沉郁、毛色竖起蓬乱、反应迟钝、扎堆、食欲废绝；对照组无此现象。至48 h全部死亡，剖检可见皮下出血、腹腔有多量渗出、肺脏严重出血、肾脏均有出血点。用心血涂片革兰氏染色镜检。发现有短杆状的革兰氏阴性菌，PCR 扩增结果为Hps 阳性，可确定小白鼠为Hps致死。对照组Balb/c 小鼠未见异常。

表2 副猪嗜血杆菌滨州株分离株药物敏感性试验结果 mm

2.7 药敏试验结果

由表2 可知，分离菌对头孢曲松、头孢噻呋钠、四环素、替米考星高度敏感；对恩诺沙星、丁胺卡那、庆大霉素中度敏感；对甲氧苄氨嘧啶、阿莫西林、链霉素、青霉素、新霉素、环丙沙星、复方新诺明等耐药。

3 讨论

副猪嗜血杆菌很娇气很难分离培养，对生长条件要求很苛刻，分离率不高，病料的新鲜程度对其成功分离影响很大，病猪死亡时间超过 12 h 采集的病料，则几乎不可能分离到 Hps。初次分离培养需要供给5%～10%的CO2促进生长，常用的培养基为胰蛋白大豆琼脂(Tryptci Syo Agar，TSA)和胰蛋白大豆肉汤(Tryptci Soy Borht，TsB)，需要在培养基中添加终浓度是0.000 1% 的NAD 和5% 的 犊 牛 血清，细菌才能生长。在分离培养的过程中，很容易被污染。临床上猪群大剂量抗生素的应用更增加了该菌的分离难度。该菌培养24～48 h 后，革兰氏染色，镜检革兰氏阴性菌，通常形态为球状、球杆状、短杆状等，其中以短杆状的革兰氏阴性菌居多；培养72 h 后，其形态为杆状或长丝状，长丝状较多。本试验分离的1 株副猪嗜血杆菌能发酵葡萄糖、果糖、麦芽糖、山梨糖、半乳糖、核糖、蔗糖、海藻糖，不能发酵甘露糖、木糖、蜜二糖、棉子糖、阿拉伯糖、乳糖、山梨醇、甘露醇。依赖NAD、不出现溶血现象、接触酶试验反应阳性，硝酸盐还原试验阳性，氧化酶、脲酶、吲哚试验、V-P 试验均呈阴性，与副猪嗜血杆菌的生化特征一致，该菌株可使实验组Balb/c 小鼠48 h 内全部死亡，表明该分离菌株有一定的致病性。根据GenBank 登录的副猪嗜血杆菌16SrRNA 基因（GU226401）设计引物，扩增出特异性条带，测序结果显示与GenBank 登录的副猪嗜血杆菌16SrRNA 基因的相似性为100%。药敏试验结果显示，该分离株对头孢曲松、头孢噻呋钠、四环素、替米考星高度敏感，对甲氧苄氨嘧啶、阿莫西林、链霉素、青霉素、新霉素、环丙沙星、复方新诺明等耐药。副猪嗜血杆菌的分离鉴定，为临床诊治提供了依据，为进一步开展该菌株的分子生物学研究和自家灭活菌苗的制备等奠定了基础。

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