固定化葡萄糖异构酶的研究进展

金利群，郭东京，廖承军

（1.浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014；2.浙江华康药业股份有限公司，浙江衢州324302）

固定化葡萄糖异构酶的研究进展

金利群1，郭东京1，廖承军2

（1.浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014；2.浙江华康药业股份有限公司，浙江衢州324302）

高果糖浆作为一种天然甜味剂，被广泛应用于食品和饮料中。葡萄糖异构酶是生产高果糖浆的关键酶之一，是重要的工业用酶，其固定化技术十分成熟，被认为是固定化酶制剂的一个范本。主要介绍了葡萄糖异构酶及其固定化方法以及葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用。

葡萄糖异构酶；固定化技术；高果糖浆

前言

高果糖浆（High Fructose Corn Syrup，HFCS）又称果葡糖浆，是一种以玉米淀粉为原料，经液化、糖化、连续异构化加工成的由葡萄糖和果糖组成的混合糖浆。高果糖浆风味纯正，口味同蜂蜜相似，作为食品、饮料等的甜味剂［1］，完全可以保证食品的营养和风味，并且不会改变人们的饮食营养结构。HFCS凭借其优良的口感和使用方便性，正在被越来越多的厂家和消费者了解。每年，世界上生产的高果糖浆就有千万吨，人们对高果糖浆日益增长的需求和高果糖浆产业的蓬勃发展，推动了人们对葡萄糖异构酶的深入研究和固定化葡萄糖异构酶技术的飞速发展。

葡萄糖异构酶（Glucose isomerase，GI），又称木糖异构酶，可以将葡糖糖异构化成果糖，是食品工业中用酶法生产HFCS的关键酶。GI是水溶性的酶，固定化后具有易分离、稳定性好、易控制等优点，更适合工业上连续化生产高果糖浆。固定化GI是重要的工业酶制剂之一。酶的固定化方法基本分为4种：吸附、共价、包埋、和交联。在此基础上，两种或两种以上的方法联合使用，又衍生出很多种。但是不同酶都有其适合的固定化方法，而这些方法中真正可以工业应用的很少。葡萄糖异构酶的固定化一直是固定化技术应用中非常成功且值得借鉴的一个例子。

1　葡萄糖异构酶简介

1957年，Marshall和Kooi从Pseudomonas hydrophila中分离到GI，发现其具有将D-葡萄糖异构化成D-果糖的能力。D-葡萄糖异构酶/木糖异构酶（D-木酮糖异构酶，EC5.3.1.5），可以异构化木糖生成木酮糖，也可以异构化葡萄糖生成果糖，是工业上生产HFCS的关键酶，习惯上称为葡萄糖异构酶。

图1　葡萄糖果糖异构酶异构化葡萄糖生成果糖

GI广泛分布在自然界中，存在于许多微生物如细菌、放线菌、真菌中，至今被鉴定的产GI的微生物菌株就有上百种之多，尤以放线菌和细菌居多。GI的产生菌株一般为嗜温菌，也有一些嗜热菌如海栖热袍菌属的Thermotoga neapolitana，最适温度分别为97℃和105℃［2］，其催化葡萄糖生成果糖的反应，转化率在26%～59%的范围内。表1为商品化GI的生产菌株。GI依据一级结构中N末端序列的不同分为Ⅰ型和Ⅱ型［3］。目前商业化GI大多数是Ⅰ型酶，其在60℃左右有较好的催化效率，对葡萄糖的亲和力高［4］。

GI的最适pH通常为中性微偏碱性，在偏酸性的条件下，大多数GI活力很低。GI最适反应温度一般在60～90℃，Ⅱ型GI的热稳定性能优于Ⅰ型GI［7］。在GI的活性中心有两个金属离子结合位点，对催化过程有直接作用。金属离子的结合对GI的活力和稳定性都具有重要的影响［8］。

表1　商品酶中使用的葡萄糖异构酶产生菌［5-6］

2　葡萄糖异构酶的固定化方法

1970年代后期固定化GI的技术已经成熟。近年来主要是一个巩固发展的阶段。固定化GI的方法主要可以归纳为以下四种：交联法、吸附法、共价结合法和包埋法。

2.1交联法

交联法是采用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子（或细胞）之间的交联，使酶分子（或细胞）和双功能或者多功能试剂之间形成共价键，得到酶分子（或细胞）之间相互交联的三维网状结构。1973年，日本学者Takasaki等［9］用热固定技术固定了表达GI的Streptomyces sp.细胞。将产酶细胞在高温（60～80℃）条件下短时间处理，形成由细胞内失活的蛋白和其他组分组成的交联基质。这种方法使细胞内的蛋白酶在高温下失活，减少了其对GI的分解作用。戊二醛是最为普遍的非常有效的交联试剂。在当今商品化GI制剂如诺维信的SweetzymeT和杰能科（杜邦公司）GensweeIGI［4］中都有应用，这也是目前占据固定化GI市场主导地位的两个产品。1973年，戊二醛交联法首次描述用于S.olivaceus细胞的固定。1976年，该方法得到进一步的改善。基本过程是用均质化的B. coagulans细胞，与戊二醛交联过后，交联复合物经过脱水，用轴向挤压机机械塑型，挤压成颗粒，在流化床干燥。该法可以结合使用阳离子絮凝剂如壳聚糖，多官能胺如聚乙烯亚胺，无机载体如膨润土、高岭土、硅藻土等，进一步提高产品的质量和性能。图2为杰能科（杜邦公司）产品GensweeIGI的生产工艺流程，这样制成的固定化GI极其稳定，在60℃填充床上使用，半衰期可以超过一年。

图2　Gensweet® IGI的生产工艺

国内也有相关的研究，吴敬等［10］以产GI的重组构建的大肠杆菌xylA/pET-24a/BL21（DE3）作为生产菌株，在初始培养基中添加适量的Co2+发酵生产GI。直接向发酵液中添加壳聚糖溶液，使菌体絮凝。絮凝后的菌体再用戊二醛进行交联，挤压成型后烘干过夜。固定化后GI的酶活为2 579 U/g，酶活回收率达到70.5%，添加金属离子后，在75℃下半衰期为29 h。在相同的转化时间内，以50%葡萄糖为底物连续操作10次，其相对转化率为71%。该固定化方法简单易行，固定化酶颗粒的性能优异，可为工业化应用提供参考。

除戊二醛外，可以使用的交联剂还有盐溶液、柠檬酸、聚氮杂环丁烷、氰尿酰氯、二环氧化物、二异氰酸酯等。

2.2吸附法

基于吸附的固定化方法是最早发展起来的酶的固定化方法之一。几乎是交联法发展的同时，树脂离子吸附GI的固定化方法也在进行着。尽管从宿主细胞中释放和纯化游离酶的过程会产生额外的费用，但是这种产品的物理形式具有相当大的操作优势。Antri等［11］发明了一种可再生的产品，载体为颗粒状的DEAE-纤维素-聚苯乙烯-氧化钛树脂，颗粒大小在400到800 μm范围内。从S.rubiginosus中分离并且高度纯化的GI，静电吸附到树脂上获得的固定化GI，具有高催化密度，酶活可以达到1 500 U/g。固定化酶稳定性也比较好，在工厂操作条件下，半衰期超过1 800 h。这个方法的特点是固定化酶具有可再生的能力，可以通过添加游离的GI来补偿随着时间损失的酶。贺家明等［12］用嗜热放线菌Streptomyces M1033制备固定化GI生产HFCS，该菌胞外产酶占90%以上，用离子交换树脂（大孔强碱性苯乙烯系季氨基阴离子交换树脂）吸附发酵液中的酶，即固定化GI，酶活力8 000～10 000 U/g（干重），酶活回收率65%～70%。辛嘉英等［13］以A12O3为载体，采用先吸附后交联的方法固定化GI，制得了酶活性损失少和稳定性较高的固定化GI。

2.3共价结合法

共价结合法是酶蛋白分子或细胞表面上的活性功能团（不在酶活性位点或底物结合位点的氨基或羧基）和固体载体表面的反应基团之间形成化学共价键连接。该法的优点是酶与载体结合紧密，稳定性好，不易从载体上脱落。缺点是反应条件激烈、对酶活影响较大、酶活回收率低。已建立的方法包括：重氮法、烷基化法、肽键法和芳基化法［14］。郭杨龙［15］，陈栋等［16］制备了可以用于GI的醛基介孔分子筛和环氧基介孔分子筛，使酶分子可以直接以共价结合的方式固定在分子筛表面，提高酶的性能。Corning玻璃厂发明了共价吸附固定的方法，使用无机载体如铝、氧化钛、可控制孔径大小的玻璃等。该法用氨基硅烷表面修饰无机载体，耦合试剂如碳二亚胺介导共价吸附固定酶。得到的固定化酶活力有几百个单位。这种方法又称为类共价吸附固定法，两性分子通过疏水相互作用把它们吸附在疏水载体表面，余下的亲水部分用于结合酶。如Eaton等［17］发明的一种方法，将GI固定在多孔的MgO/Al2O3上。在复合材料中使用氧化镁的优点是可以提供GI需要的镁离子，提供pH有利的微环境。

2.4包埋法

酶的包埋是借助化学或物理的方法（如交联或凝胶化）将酶包埋在载体中的过程，包埋载体一般在固定化过程中形成。酶或细胞可以被物理包埋或共价连接到载体上。用交联的基质包埋酶或细胞是一种非常普遍的固定化方法。早期主要致力于将游离的GI固定于三乙酸纤维素纤维和胶原蛋白膜上。1976年，Gist-Brocades公司将表达GI的细胞A.missouriensis包埋在戊二醛交联的明胶基质中，并商品化生产。基本过程是：将含有GI的菌丝体与明胶混合，在40℃条件下，随后边搅拌边加入到与水不混溶的溶剂中，形成凝胶颗粒，直径1 mm。颗粒用与水可混溶的溶剂（如乙醇）洗涤。然后用2.5%戊二醛在冷水中处理，用乙醇或丙酮冲洗，干燥或是存储于含有0.3%甲醇的NaCl溶液中。湿颗粒的活力可达6 000 U/g，连续转化半衰期可达500 h。包埋法固定化酶或细胞可以根据不同的应用和包埋方法比较容易地制成各种各样的形式，可以用于分批、固定床、扩张床等各种反应器中。

3　固定化GI在HFCS生产中的应用

HFCS作为甜味剂占据着有营养作用的甜味剂的70%的市场份额。甜味剂是重要的调味品之一，可改进食品的可口性并有预防和治疗作用。HFCS是一种天然的营养型甜味剂，风味独特，甜度是蔗糖的1.1倍，而卡路里含量却更低，同时还具有不同于蔗糖的优良食品加工性，且可用廉价的原料通过GI简单方便的生产。由于传统甜味剂蔗糖价格上升，凭借其诸多优良的性能，高果糖浆正成为其替代品，成为广大消费者追求健康生活的首选糖源。高果糖浆被广泛应用于饮料、烘焙、调味品、罐头、糖果、保健品、雪糕等生产中。

1967年，美国Clinton Corn Processing公司首次成功地进行GI异构化葡萄糖工业规模的应用。1974年，该公司首先应用DEAE-纤维素制备的固定化GI生产HFCS。异构化过程由生产初期的间歇法转向用固定化酶的连续生产。目前，工业生产HFCS主要以玉米淀粉为原料通过三步酶法即淀粉经α-淀粉酶液化，β-糖苷酶糖化，得到的葡萄糖浆再经GI异构化，得到果糖含量为42%的HFCS［18］。后经色谱浓缩、分离得到果糖浓度为55%的HFCS，如图3所示。

图3　酶法生产高果糖浆工艺流程

葡萄糖异构化过程使用填充床连续反应系统。GI催化工艺底物浓度40%～45%（干基重，约95%的葡萄糖），粘度高，需要在高温下进行操作，且高温可以避免微生物污染。在进入填充床异构化反应前，对水解工艺得到的葡萄糖浆需要进行过滤、活性炭吸附、离子交换处理。除去对GI有抑制作用的Ca2+，加入有激活作用的Mg2+。图4为固定化GI在填充床上连续转化葡萄糖浆的工艺流程［19］，果糖生产能力为100 t/a。用并联的填充床反应器，管束中装有不同失活程度的酶。每个酶批次的使用时段和温度都进行调整，用于调节并稳定生产能力。

图4　葡萄糖异构酶催化生产高果糖浆工艺流程

4　展望

从葡糖糖到HFCS的GI工艺，是最大的生物催化工艺，每年全世界的生产量超过1 000万吨，这也使得固定化GI成为世界上最重要的工业酶制剂之一。国外GI的固定化技术研究较早，技术成熟。而我国的固定化GI市场一直被国外公司垄断，造成果葡糖浆的生产成本过高。国内固定化GI的水平还有很大的上升空间。

HFCS工艺的一个公开技术挑战是设计出在一定温度下操作充分稳定的GI，在此温度下，能使平衡更适于在柱中直接转化为55%的果糖。因为软饮料与食品需要55%的果葡糖浆以获得与相同量的蔗糖同等的甜度，因此不得不用色谱法浓缩。如果酶在90～95℃依然稳定，就能直接得到55%的果葡糖浆，可省略费用昂贵的浓缩步骤。因此，研究高温下GI的稳定性和催化性能具有重要意义。

温度升高，葡糖糖异构化生成果糖的反应平衡向果糖移动，反应速度加快，这样就可以减少固定化GI在填充床中的停留时间，从而减少副产物的生成，也降低了反应所需的酶量，同时还可以增加难溶物质如淀粉类、纤维素类等的溶解性和可利用性，降低有机化合物的黏度而利于反应进行。对反应的冷却系统要求降低，因而降低了能耗，既可降低成本，又可减少冷却过程对环境造成的污染［20-21］。

人们对GI的热稳定性进行了大量的研究。商品酶Sweetzyme® T的菌种来源于S.murinus，该酶的最适温度为85℃。Jorgensen等研究了该酶在55℃到90℃下酶活和产量的变化，反应在填充柱中进行。尽管酶活力随着温度的升高而增大，产量确实随着温度的升高而降低。因为酶在高温下的衰退速率非常大，温度越高，使用时间越短。HFCS的产量来不及大量积累，酶已基本失活。Lim等［22］研究了固定化GI和游离酶的热失活机制，发现GI的巯基氧化反应以及GI和糖之间的美拉德反应是引起酶热失活的部分原因。Bandlish等［23］的研究中，比较了两种来源于极端嗜热菌酶和一种来源于S.murinus的耐热GI。利用固定化耐热GI（共价固定在玻璃珠上），在80℃，添加金属离子的情况下转化葡萄糖，1 kg酶大约可生产2 000 kg的果糖，得到了一个既有高转化率又有商业化可能产量的固定化极端耐热GI。这一结果为高温条件催化得到55%果糖浓度的HFCS带来希望，但是需要进一步的研究热稳定性和热活力的关系，以及维持高温下果糖稳定性的办法。

［1］杨海军.前景看好的甜味剂——果葡糖浆［J］.发酵科技通讯，2006，35（4）：32-35.

［2］VIEILLE C，SRIPRAPUNDH D，KELLY R M，et al.Xylose isomerases from Thermotoga［J］.Methods in Enzymology，1989，330（12）：215-224.

［3］VANGRYSPERRE W，VAN DAMME J，VANDEKERCKHOVE J，et al.Localization of the essential histidine and carboxylate group in D-xylose isomerases［J］.Biochemical Journal，1990，265（3）：699-705.

［4］DICOSIMO R，MCAULIFFE J，POULOSE A J，et al.Industrial use of immobilized enzymes［J］.Chemical Society Reviews，2013，42（15）：6437-6474.

［5］BHOSALE S H，RAO M B，DESHPANDE V V.Molecular and industrial aspects of glucose isomerase［J］.Microbiological Reviews.1996，60（2）：280.

［6］JENSEN V J，RUGH S.Industrial scale production and application of immobilized glucose isomerase［J］.Methods in Enzymology.1987，136：356-370.

［7］朱国萍，程阳，宫春红，等.葡萄糖异构酶的生物工程研究进展［J］.生物化学与生物物理进展，2000，27（2）：127-131.

［8］HARTLEY B S，HANLON N，JACKSON R J，et al.Glucose isomerase：insights into protein engineering for increased thermostability［J］.Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology，2000，1543（2）：294-335.

［9］TAKASAKI Y，KAMIBAYASHI A.Method of converting glucose into fructose：US，3753858［P］.1973.

［10］吴敬，杨帆，邓辉，等.一种葡萄糖异构酶的固定化方法：中国，102994490［P］.2013.

［11］ANTRI R L，AUTERINEN A L.A new regenerable immobilized glucose isomerase［J］.Starch-Stärke，1986，38（4）：132-137.

［12］贺家明，袁建国.用嗜热放线菌生产固定化葡萄糖异构酶的方法及应用于高果糖浆的生产方法：中国，85100412［P］. 1987.

［13］辛嘉英，黄友梅，刘文圣.葡萄糖异构酶的固定化及其稳定性的研究［J］.甘肃科学学报，1994，6（2）：23-25.

［14］于海涛.葡萄糖异构酶的固定化及其性能研究［D］.上海：华东理工大学硕士研究论文，2011.

［15］郭杨龙，高振源，田程程.用于生物酶固定化的醛基介孔分子筛：中国，101851618［P］.2010.

［16］陈栋，高振源，杨波.用于生物酶固定化的环氧基介孔分子筛：中国，101864410［P］.2010.

［17］EATON D L，MESSING R A.Immobilized glucose isomerase：US，3982997［P］.1976.

［18］刘成龙，周海岩，柳志强，等.葡萄糖异构酶及其在高果糖浆生产中的应用［J］.氨基酸和生物资源，2014，36（3）：12-19.

［19］ANDREAS S，BOMMARIUS，BETTINA R.et al.Biocatalysis：Fundamentals and Applications［M］.北京：化学工业出版社，2005，05：426.

［20］王顺民，董文宾.嗜热酶的研究及其在食品等相关工业的应用［J］.自然杂志，2004，26（6）：339-342.

［21］李淑彬，陆广欣，林如妹，等.嗜热菌—工业用酶的新来源［J］.中国生物工程杂志，2003，23（7）：67-71.

［22］LIM L H，SAVILLE B A.Thermoinactivation mechanism of glucose isomerase［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2007，137-140（1-12）：115-130.

［23］BANDLISH R K，MICHAEL HESS J，EPTING K L，et al.Glucose-to-fructose conversion at high temperature with xylsoe（glucose）isomerase from Streptomyces murinus and to hyperthermophilic Thermotoga species［J］.Biotechnology and Bioengineering，2002，80（2）：185-194.

（责任编辑：朱小惠）

Progress in immobilized glucose isomerase

JIN Liqun1，GUO Dongjing1，LIAO Chengjun2
（1.Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.Zhejiang Huakang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Quzhou 324302，China）

High fructose corn syrup，a natural sweetener，has been widely used in foods and beverages.Glucose isomerase is one of the key enzymes in the production of high fructose corn syrup.It is an important industrial enzyme in commerce today.Its immobilization technology is very mature and considered to be the paradigm for enzyme immobilization This paper described the glucose isomerase and its immobilization，and its application in the production of high fructose corn syrup was also introduced.

glucose isomerase；immobilization；high fructose corn syrup

Q814.2

A

1674-2214（2015）03-0047-05

2015-05-13

国家自然科学基金资助项目（31401527）

金利群（1976—），女，浙江东阳人，副教授，博士，研究方向为生物催化与酶工程，E-mail：jlq@zjut.edu.cn.