双水相萃取鼠李糖乳杆菌生物胺氧化酶条件的优化*

赵思远，卢士玲

(石河子大学食品学院，新疆石河子，832000)

生物胺(biogenic amines，BA)是一类含有杂环结构、芳香族和脂肪族有机物，广泛存在于食品和生物体中，尤其在发酵肉制品中。主要分为单胺、二胺和多胺。适量的生物胺对人体有一定的调节作用，如调节生长、促进代谢、控制血压、清除自由基等［1］。而过量的生物胺则会给人体带来一些不良影响，如引起头晕、心悸、血压改变、呼吸困难等应激反应，严重时还会对神经和心血管系统造成损伤，引起脑出血，甚至死亡［2］。还有一些生物胺，如腐胺、尸胺等能够与亚硝酸盐反应生成亚硝胺等致癌物质［3］。

生物胺氧化酶可催化生物胺发生脱氢反应，形成过氧化氢、氨和醛，以减少生物胺在生物体中的含量，从而降低毒害作用。如色胺生成吲哚乙醛，组胺生成咪唑乙醛，苯乙胺生成对羟基苯乙醛等，酪胺生成苯乙醛。反应由单胺氧化酶介导，该酶不论在微生物或者哺乳动物体内均广泛存在，起到代谢生物胺，维持机体生物胺处于低生理浓度的生理功能［4］。

双水相萃取是利用溶质在两水相之间分配系数的不同来进行萃取的一种方法，该体系具有含水量高，萃取环境和操作条件温和，不易使蛋白质在萃取过程中失活，易于按比例放大和进行连续性操作等优点［5］，通过调整双水相系统中一系列参数就可选择性地萃取目标蛋白酶［6］。因此，近些年，采用双水相萃取技术提取酶、抗生素、氨基酸天然产物等小分子物质日益受到关注［7－8］，对于酶的萃取有很好的具有良好的应用潜力［9］。

鼠李糖乳杆菌为革兰氏阳性菌，可产生生物胺氧化酶［10］。本实验采用聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取鼠李糖乳杆菌在培养过程产生的生物胺氧化酶。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG，LGG)，石河子大学食品学院畜产实验室。

1.2 试剂与仪器

聚乙二醇400、聚乙二醇6000，天津市盛奥化学试剂有限公司;聚乙二醇2000，天津市光复精细化工研究所;(NH4)2SO4，天津永晟精细化工有限公司;MRS培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司;考马斯亮蓝G-250(分析纯)，上海化学试剂供应站;牛血清蛋白，美国BIOSHARP公司。

立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;DNP-9272型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司;美国Sonics＆materials VCX500超声波细胞破碎仪;台式高速冷冻离心机，力康发展有限公司;日本岛津紫外可见光分光光度计UVmini－1240。

1.3 实验方法

1.3.1 生物胺氧化酶(粗酶)的提取

选取活性较好的鼠李糖乳杆菌，在MRS液体培养基中活化2次。用超声波细胞破碎机对鼠李糖乳杆菌进行破碎，在冰浴中进行，500 W，破碎3 s，间隔2 s，破碎10 min。破碎后，将其置于冷冻离心机中，4℃，7 500 r/min 离心15 min。

1.3.2 双水相相图的绘制［11］

分别配制40%的PEG溶液和40%的(NH4)2SO4溶液。称取一定质量的PEG溶液(P)置于三角瓶中，加入(NH4)2SO4，直至开始出现浑浊为止，记录加入的(NH4)2SO4质量(Q)。再向体系中加入水，直至浑浊消失，记录水的质量(W)。再次向体系中加入(NH4)2SO4和水，溶液再次变为浑浊进而又变为澄清。如此循环，形成不同的成相点。计算成相点绘制PEG和(NH4)2SO4形成的双水相体系的相图:

X/%=P/(P+Q+W)×100

Y/%=Q/(P+Q+W)×100

X，在某成单相点时硫酸按占总量的质量百分数;Y，在某单相点时，PEG占总量的质量百分数。

以X为横坐标，Y为纵坐标，X对Y作图得到PEG/硫酸铵双水相系统相图(图1)，相图中曲线以下为单相区(含曲线)，曲线以上为双相区。

1.3.3 双水相萃取生物胺氧化酶［12］

称取一定量聚乙二醇、(NH4)2SO4和蒸馏水于小烧杯中，加入2 mL的粗酶液，使双水相体系总质量为10.00 g，充分振荡使成相物质溶解，并调节体系pH，静置10 min，离心10 min，2 000 r/min，使两相达到相分离［13］。称取上相和下相的体积。由此可得到:

相比:R=Vt/Vb

分配系数:K=Ut/Ub

回收率:Y=R/(1+RK)

Vt、Vb分别为双水相体系中上相与下相的体积，Ut、Ub为上相与下相的酶活。

1.3.4 酶活性的测定［14－15］

取2 mL PBS(0.1 mol/L，pH 7.0)、0.1 mL 过氧化物酶溶液(1 mg/mL)及0.2 mL PAO提取液。混合液于30℃水浴预保温2 min后分别加入0.1 mL生物胺混合液(20 mmol/L)起动反应，并用分光光度计连续测定波长430 nm处光密度值的变化。

生物胺氧化酶酶活力定义:以混合生物胺作为底物，1 min引起吸光值变化0.001所需要的酶量，用0.001ΔOD430/min 为1 个酶活力单位(U)［16］。

1.3.5 蛋白含量的测定［17］

采用Bradford Protein Assay(考马斯亮蓝G-250)法测定蛋白质浓度。标准曲线方程为:y=8.495 2x+0.016 6，单位:mg/mL。

2 结果与分析

2.1 聚乙二醇/硫酸铵双水相体系相图

图1为一定浓度不同分子质量的聚乙二醇(PEG400、PEG2000、PEG6000)与 一 定 浓 度 的(NH4)2SO4所形成的双水相体系相图。根据该图可以确定聚乙二醇/硫酸铵双水相体系成相的基本情况，从而确定实验操作的基本条件，当 PEG和(NH4)2SO4分别高于某一浓度时(位于图1中双结线的上方)才能分相形成双水相系统。当(NH4)2SO4的浓度一定时，随着PEG分子质量的增大，所需PEG的浓度越低，越容易与(NH4)2SO4形成双水相体系。

图1 不同分子质量的聚乙二醇与硫酸按的双水相相图Fig.1 Phase diagram of different kind of molecular mass PEG/(NH4)2SO4in aqueous two-phase system

2.2 不同分子质量的PEG对生物胺氧化酶萃取的影响

选择同一浓度不同分子质量的PEG与同一浓度的(NH4)2SO4配制双水相体系，并对相同体积的生物胺氧化酶粗酶液进行萃取。选择分子质量为2 000的PEG，生物胺氧化酶在上相的酶活最高，其比酶活也较高。

2.3 不同浓度的PEG对萃取的影响

选用同一浓度的(NH4)2SO4与不同浓度的PEG2000配制双水相体系，并对生物胺氧化酶粗酶液进行萃取。实验结果如表1。选择浓度需远离双水相相图的双结线，否则不利于成相，但浓度若高于40%则可能导致酶失去活性［7］。

表1 PEG质量分数对生物胺氧化酶分配行为的影响Table 1 Effect of PEG concentration on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

PEG在低浓度时对酶活性有一定的促进作用，随着浓度的增大对酶活性的抑制作用增大。由数据可知，随着PEG质量分数的增大，其萃取萃取率、酶的分配系数以及纯化倍数均有增加。但PEG的质量分数越大，其黏度越大，增强了溶质在相间和相内传递的阻力，使酶不易进入上相，分配系数降低，不易选择过高质量分数的 PEG。因此，选择 25%的PEG2000最为合适。

2.4 不同浓度的(NH4)2SO4对萃取的影响

选用不同浓度的(NH4)2SO4与同浓度的PEG2000配制双水相体系，并对生物胺氧化酶粗酶液进行萃取。无机盐的盐析作用是双水相成相的主要原因之一，增大无机盐的质量分数，无机盐的盐析作用加强，酶更趋向分配于上相，但过多的无机盐对酶的活性影响很大，所以无机盐的质量分数不易太大。由表2可以看出选择10%的(NH4)2SO4对生物胺氧化酶进行萃取最为合适，萃取率达到93.4%。当(NH4)2SO4的质量分数低于8%成相困难，随着(NH4)2SO4的质量分数增加，萃取率和纯化倍数均有增加，但当(NH4)2SO4的质量分数达到14%时，体系中开始有少量晶体析出，使得部分酶吸附在相界面处，分配系数下降，纯化倍数降低。

表2 (NH4)2SO4质量分数对生物胺氧化酶分配行为的影响Table 2 Effect of(NH2)SO4concentration on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

2.5 pH值对萃取的影响

pH值可以改变蛋白质表面氨基酸残基电荷的种类和多少，从而影响蛋白质与体系的氢键和静电作用，改变系统上下两相的电位差，导致蛋白质带电性质改变进而影响酶在双水相中的分配行为。体系的pH值与蛋白质的pI相差越大，蛋白质在两相中的分配越不平衡。需要将pH控制在生物胺氧化酶稳定的范围内，本实验中的生物胺氧化酶为混合酶，pI约为7.0～7.4。由表3可以看出，对不同pH值的双水相体系进行萃取实验，当pH值为7.5时，得到最大萃取率，分配系数K与纯化倍数P也均高于其他pH值的PEG/硫酸铵双水相体系。

表3 pH值对生物胺氧化酶分配行为的影响Table 3 Effect of pH value on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

2.6 温度对萃取的影响

由表4可以看出，本实验中，温度对萃取的影响并不明显，综合萃取率、分配系数和纯化倍数3个实验数据，选择30℃为最佳萃取温度。

表4 温度对生物胺氧化酶分配行为的影响Table 4 Effect of temperature on partitioning behaviour of biogenic amine oxidase

2.7 响应面结果分析

根据单因素实验结果，选取4因素3水平用Box-Behnken法进行响应面实验设计及分析。4因素分别为:PEG质量分数(A)、(NH4)2SO4质量分数(B)、pH值(C)、温度(D)，分别选取3水平进行实验，如表5。实验设计见表6，图2和图3为3D响应面图。

表5 Box-Behnken设计因素水平表Table 5 Factors and levels of Box-Behnken Design

对萃取率进行Box-Behnken试验结果的回归分析。模型P=0.000 1＜0.05，说明模型拟合程度极高，其中AD＞AB＞AC＞BC＞CD＞BD，温度与PEG质量分数的交互作用最强，而温度与硫酸铵质量分数以及pH的交互影响则最弱。综合4个因素，温度对萃取率影响显著，其次是pH值。经数据分析，其决定系数R2=0.979 1，说明该方程与实际情况拟合良好，较好地反映了生物胺氧化酶的提取率与PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数、pH值和温度之间的关系。图3为萃取率的响应面分析图。经回归拟合后，试验因子对响应值Y(萃取率)的影响可用以下回归方程表示:

Y=－1 090.510 00+7.086 67A+19.483 33B+227.533 33C+9.859 33D+0.125 00AB－0.120 00AC－0.020 000AD－0.100 000BC－0.050 000BD+0.010 00CD－0.132 40A2－1.019 38B2－15.010 00C2－0.146 10D2

表6 Box-Behnken设计方案与结果Table 6 Arrangement and results of Box-Behnken Design

模型P=0.000 1＜0.05，说明模型拟合程度极高，其中AC、AD＞BD＞AB＞BC＞CD，说明PEG质量分数与pH值以及温度交互作用最强，而pH值与温度交互作用最弱。综合4个因素，PEG质量分数和温度对纯化倍数影响显著，其次是(NH4)2SO4质量分数和pH值。决定系数R2=0.994 2，说明该方程与实际情况拟合极好，较好地反映了生物胺氧化酶的纯化倍数与PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数、pH值和温度之间的关系。图4为萃取率的响应面分析图。经回归拟合后，试验因子对响应值P(纯化倍数)的影响可用以下回归方程表示:

P=－138.447 25+2.671 33A+3.225 42B+22.098 33C+0.620 27D－0.018 500AB+0.156 00AC+9.200 00E－003AD－0.050 000BC－0.010 500BD+2.000 00E－003CD－0.078 240A2－0.108 50B2－1.711 00C2－0.012 910D2

图2 萃取率(Y)的响应面分析Fig.2 Response surface analysis on Y

图3 纯化倍数(P)的响应面分析Fig.3 Response surface analysis on P

最大萃取率的实验条件为(条件1):质量分数为25%的PEG2000、质量分数为10%的(NH4)2SO4、pH值为7.5、温度为30℃;得到最大纯化倍数的实验条件为(条件2):质量分数为25%的PEG2000、质量分数为10%的(NH4)2SO4、pH值为7.5、25℃。对2种实验条件进行验证实验，以条件1进行萃取得到萃取率为96.5%，纯化倍数为2.38;以条件2进行萃取得到萃取率为95.2%，纯化倍数为2.36。因此，选择条件1为最优实验条件。

3 结论

经过响应面试验结果分析，用聚乙二醇/硫酸铵双水相体系对生物胺氧化酶进行萃取时，结果较为理想，该实验萃取条件与其他氧化酶及蛋白在同一范围内［7－8，11－13，17］，因此也同样具有放大潜能。

聚乙二醇的分子质量越大越容易分相，但由于分子质量增大同时会增大PEG的浓黏度，导致分相时间增长，导致生物胺氧化酶难以进入上相;PEG的浓度增大也同样增加了PEG相的黏度，延缓分相，降低生物胺氧化酶的分配系数和纯化倍数;(NH4)2SO4容易结晶析出，吸附部分生物胺氧化酶于分相界面处;pH值不能与生物胺氧化酶的等电点pI相差过大，否则影响酶的萃取;温度会影响 PEG和(NH4)2SO4的状态和分相速度以及酶的活性，因此这些因素对生物胺氧化酶的萃取都有重要影响。经过响应面分析，PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数、pH值和温度4个因素交互作用时，其中硫酸铵质量分数对萃取的影响略弱，其他均强。

最终得到优化的萃取鼠李糖乳杆菌所产生物胺氧化酶的条件为:质量分数为25%的PEG2000、质量分数为10%的(NH4)2SO4、pH值为7.5、温度为30℃，实验的萃取率为96.5，纯化倍数为2.38。在下一步的实验中，可模拟工艺生产条件，大量萃取生物胺氧化酶，并对其工艺生产条件进行优化。

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