痛泻要方治疗溃疡性结肠炎模型大鼠的药效学机制

朱向东 曹燕飞 汪 斌 王 燕 段永强 (甘肃中医学院基础课部，甘肃 兰州 730000)

溃疡性结肠炎(UC)是以腹痛腹泻、黏液脓血便持续或反复发作为主要临床症状，以结肠黏膜及黏膜下层炎症和溃疡形成为病理特点的慢性非特异性肠道疾病。该病发病原因及机制尚不完全清楚，加之其病情缠绵难愈，复发率高，且有癌变倾向，目前尚缺乏满意的治疗方法，已被列为现代难治病之一〔1〕。本研究旨在探讨痛泻要方治疗性UC的疗效，药效作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 采用SPF级Wistar大鼠30只，体重(180±10)g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供，SPF级动物质量合格证号:SCXKC(甘)2004-0006;SPF级实验设施合格证号:SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.2主要药物与试剂 痛泻要方制剂的主要制备方法:痛泻要方颗粒(由陈皮、白术、白芍、防风等四味药物组成)，由甘肃中医学院附属医院制剂室协助加工制备。按处方比例取陈皮、白术、白芍、防风，用8倍量70%的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取药渣。合并3次醇提取液，滤过，滤液减压回收乙醇后得醇提取浓缩液，醇提取浓缩液干燥得干膏，干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏，冰箱保存备用。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS):购于北京邦定泰克生物技术有限公司，由美国sigma公司生产，批号为〔2008-16-2〕。髓过氧化物酶(MPO)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、MDA检测试剂盒，购于南京建成生物工程技术研究所。

1.3造模方法 采用TNBS/乙醇溶液灌肠结合束缚法制备UC肝郁脾虚大鼠模型:模型组和痛泻要方组每天采用束缚器束缚大鼠四肢，并且限制其自由活动，每次6 h。束缚器束缚1 w后，开始行TNBS/乙醇溶液灌肠制备模型。将模型组和痛泻要方组大鼠禁食24 h，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 ml/100 g)后，一次性将TNBS/乙醇液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用橡胶输液管慢慢注入距大鼠肛门约7～8 cm深的结肠处，在肠腔里置留数分钟，并且让大鼠处于平躺状态，待其自然清醒。第2天即成功复制UC模型。UC模型成功后，每日仍继续用束缚器束缚大鼠四肢，持续1 w。空白组10只大鼠用同样的方法予50%乙醇溶液灌肠。第3周末处死大鼠。

1.4分组与给药 将实验动物分为3组:空白组、模型组、痛泻要方组，每组10只。除空白组外均以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合试剂灌肠。痛泻要方组按生药22 g/kg剂量灌胃(按照临床成人用量的10倍折算)，灌胃体积均为10 ml/kg，空白组、模型组灌服等体积生理盐水。各组于造模后第2天开始灌胃，1次/d，连续21 d。3 w后，处死，取标本。

1.5取材和指标观察 给药21 d后，脱颈椎处死，摘取脾脏与胸腺，称质量，计算脾脏指数与胸腺指数。迅速分离结肠、剪开、生理盐水冲洗干净，将肠黏膜向上平铺于蜡板上固定，剪取结肠组织病变严重的部分，一部分用于观察结肠组织PPAR-γ蛋白表达，一部分用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋、病理切片，行HE染色，光镜下观察结肠组织病理形态，并参考结肠病理组织学评分标准，由两位富有经验的病理教研室老师进行双盲评分，评分标准为:①炎细胞浸润:无0分，轻度1分，重度2分;②浸润深度:黏膜层1分，黏膜和黏膜下层2分，结肠全层3分;③溃疡深度:无0分，上皮1分，黏膜固有层2分，黏膜肌层3分。一部分结肠组织称重后剪碎、匀浆、离心，取上清液置于冰箱保存，检测时取结肠组织上清液分别测定 SOD、MDA、MPO、T-AOC活性，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.6免疫组织化学检测 采取经典的 SABC法，其主要步骤是:将固定好的石蜡切片常规脱蜡至水。每张切片滴加3%H2O2，室温放置10 min。将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)中进行抗原热修复，自然冷却至室温，滴加5%BSA封闭液，室温20 min。分别滴加PPAR-γ一抗，4℃冰箱过夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37℃培养箱中孵育20 min。滴加试剂SABC，在37℃培养箱中孵育20 min。DAB显色剂，苏木素轻度复染3 min;经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在显微镜下观察结果，拍片。染色对照:同一组片中，用PBS代替一抗作孵育，其余步骤同上。

1.7PPAR-γ蛋白表达结果判定及测量方法 PPAR-γ蛋白表达:主要表达于大鼠结肠组织中的肠道黏膜及黏膜下层，以胞质为主。PPAR-γ表达阳性为胞质呈黄绿颗粒染色，颜色越深，表达越强，未出现黄绿颗粒，为阴性。采用BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统，随机选取5个视野，测量阳性细胞平均灰度值，灰度值大，蛋白表达多，反之则表达少。

1.8统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1大鼠一般状态 模型组大鼠于造模后均出现肛门粪便沾染，大便稀软不成形，精神萎靡不振，毛色逐渐变暗、无光泽、懒动、喜扎堆、竖毛、食量下降、便稀、体重下降等表现，经过痛泻要方治疗后，大鼠皮毛逐渐变得光亮整洁，精神状态逐渐趋向好转，治疗结束后活动活跃，大便由稀便逐渐至成形，软硬适中，与正常组相一致。

2.2痛泻要方对UC大鼠结肠组织病理形态的影响 模型组大鼠结肠组织有溃疡，且溃疡面较大，溃疡深度大多至黏膜肌层;有明显的炎细胞浸润，且浸润深至全层;可见血管扩张充血、有糜烂，病变结肠黏膜可见中性粒细胞浸润，黏膜上皮层有缺失，固有层腺体明显减少及破坏，黏膜下层部分可见血管增生。痛泻要方治疗组损伤明显改善，溃疡基本愈合，腺体增生愈合，有明显的愈合面存在。结肠病理组织学评分结果见表1、图1。

2.3痛泻要方对UC大鼠结肠黏膜PPAR-γ蛋白表达的影响空白组PPAR-γ蛋白大量表达。模型组PPAR-γ蛋白表达较少，数量较少;痛泻要方组PPAR-γ蛋白表达较强，数量较多。阳性细胞平均光密度值结果见表1、图1。

表1 痛泻要方对UC模型大鼠结肠黏膜PPAR-γ蛋白表达平均光密度值的影响(x ± s，n=10)

图1 各组大鼠结肠组织病理形态和PPAR-γ免疫组化结果

2.4痛泻要方对UC大鼠胸腺、脾脏指数及结肠组织MPO、TAOC、SOD活性及MDA活性的影响 见表2～表4。

表2 各组大鼠脾脏指数和胸腺指数的比较(x ± s，n=10)

表3 各组大鼠结肠组织MPO和T-AOC的比较(x ± s，n=10)

表4 各组大鼠结肠组织SOD和MDA的比较(x ± s，n=10)

3 讨论

本实验观察到模型组大鼠结肠组织有溃疡，且溃疡面较大，溃疡深度大多至黏膜肌层;有明显的炎细胞浸润，且浸润深至全层;可见血管扩张充血、有糜烂，病变结肠黏膜可见中性粒细胞浸润，黏膜上皮层有缺失，固有层腺体明显减少及破坏，黏膜下层部分可见血管增生，说明UC模型的制作是成功的。

现代医学认为UC的发生是多种因素综合作用的结果，其中结肠黏膜免疫紊乱被认为是公认的发病机制〔2〕。氧自由基(OFR)在UC发病程中起着重要作用，已有大量直接或间接的证据提示UC肠黏膜中OFR水平明显升高。SOD活性是反映细胞膜功能和机体炎症反应的主要指标。MDA是一种脂质过氧化产物，反映机体细胞受氧自由基攻击的严重程度〔3〕。本实验结果提示在UC的发病中，氧自由基诱发的脂质过氧化反应很可能起着重要作用。经痛泻要方治疗后UC大鼠结肠组织中SOD活性明显升高，MDA浓度明显下降，证明痛泻要方具有清除细胞中的氧自由基，提高组织中SOD活性、抑制MDA的产生，稳定细胞膜的作用;T-AOC能反映机体抗氧化系统协同完整的抗氧化能力〔4，5〕。本实验结果提示痛泻要方具有良好的抗氧化能力，这可能是其对肠黏膜修复的作用机制之一;脾脏指数和胸腺指数的变化是反映机体免疫功能状态的敏感指标，有研究证实UC大鼠胸腺指数和脾脏指数均明显降低〔6〕。本实验结果表明，模型组大鼠脾脏指数明显低于空白组，可能与大鼠结肠组织局部的炎性反应、免疫功能紊乱有关〔7〕。经痛泻要方治疗后，UC大鼠胸腺、脾脏指数均明显升高，说明痛泻要方可能是通过恢复UC大鼠胸腺和脾脏的功能而实现对免疫反应异常的调节。

近年来研究发现，PPAR-γ具有调节炎症、脂肪代谢、细胞分化、免疫等作用〔8〕，参与多种慢性免疫性疾病的发生及发展。特别是PPAR-γ在免疫调节、炎症反应中的作用是近年研究的热点〔9〕，临床上 PPAR-γ 激动剂治疗 UC 确有疗效〔10～12〕。本研究提示PPAR-γ的表达变化可能参与了 UC发病，痛泻要方提高PPAR-γ的表达水平可能是其治疗UC的作用机制之一。

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