莲子心总生物碱的毒性试验研究

杨小青，宋金春*，谢顺岚，郝好华

1武汉大学人民医院，武汉 430060；2武汉大学药学院，武汉 430072

随着中药在国内外市场中所占比例日趋增大，中药现代化和国际接轨已成客观现实，这一发展使中药毒理学的研究愈发重要。现代研究表明，莲子心生物碱具有抗高血压、抗脂肪形成、抗高血脂、抗肥胖、镇静等多种药理作用[1-2]。目前对于莲子心总生物碱的研究主要集中于总生物碱的主成分分析，以及单体药理作用研究上，但少有针对莲子心生物碱安全性的系统评价。本研究通过莲子心总生物碱的急性毒性和长期毒性试验，以血清生化指标检测及病理切片观察相结合，旨在利用客观、科学的方法探讨莲子心总生物碱的毒副作用，对其安全性作出评价，以期为莲子心总生物碱的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV-1800型紫外可见光分光光度计；Bayer ADVIA2400全自动生化分析仪（德国西门子）及其他一些常规实验仪器设备。

莲子心（湖北天济中药饮片有限公司，规格500 g，批号：20140101）；其余试剂为分析纯。

1.2 实验动物

健康昆明种（KM）小鼠（18±2）g 20 只，雌雄各半，Sprague-Dawley（SD）大鼠（200±20） g 40 只，雌雄各半，均由武汉大学动物实验中心提供（许可证号：SCXK （鄂）2014-0013）。 标准SPF级环境下饲养，室内温度（23±2）℃，相对湿度 60%～70%，12 h白昼黑夜交替。动物适应环境一周，期间均采用标准化饮食且不受限制。本研究获得武汉大学伦理委员会和动物实验控制及监督委员会的同意与支持。

1.3 莲子心总生物碱制备

称取莲子心100 g，固液比 1∶3，加入75%乙醇充分混合后超声提取3次，每次1 h。过滤后合并滤液，旋转蒸发回收乙醇，浸膏溶液加1%盐酸调至pH 1～2，过滤，滤液用1%氨水调至pH 9～10，用等体积的氯仿萃取2次，合并氯仿层，用无水硫酸钠脱水，过滤，减压旋转蒸发回收氯仿得浸膏，用1%盐酸溶解后转移到烧杯中，1%氨水调至pH 9～10析出沉淀，加水300 mL左右静置，用砂芯漏斗过滤得沉淀，冷冻干燥得莲心总碱粉末（LPTA）2.67 g，提取率为2.67%。

1.4 莲子心总生物碱急性毒性试验

KM小鼠按性别、体重随机分为对照组与给药组，每组10只。LPTA溶于0.3%羧甲基纤维素钠（0.3%CMC-Na）的溶液中备用。给药组以小鼠最大灌胃容积0.2 mL/10 g给药，对照组小鼠给以等量容积0.3%羧甲基纤维素钠（0.3%CMC-Na）。给药后小鼠自由正常饮食，7 d内密切观察小鼠死亡率、日常活动、精神状态以及饮食情况。

1.5 莲子心总生物碱长期毒性实验

1.5.1 动物分组与采样将SD大鼠随机分为4组，每组10只，分别作为LPTA高、中、低剂量给药组和对照组。根据《中国药典》莲子心用量以及人和动物间按体表面积折算，相当于大鼠的等效剂量为13.67 mg·kg-1[3]。因此给药组分别按照剂量 400、200、100 mg·kg-1qd给予大鼠口服灌胃莲子心总生物碱提取物，连续给药30 d；对照组给予大鼠灌服等体积0.3%CMC-Na，连续30 d。实验期间，密切观察大鼠进食、饮水量以及日常活动。第30天两组给药2 h后禁食16 h，行心脏取血采集血样，血样于4℃、3500 r·min-1离心15 min，取上清液并分装，用于血清生化指标检测。

1.5.2 检测指标及方法大鼠待测血清采用ADVIA2400全自动生化分析仪检测，检测指标为肝、肾、心、血糖、血脂生化分别为丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、胆碱酯酶（CHE）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）；尿 素 氮 （BUN）、肌 酐 （Cr）、钙 （Ca2+）、 钠（Na+）、钾（K+）；天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）；总胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和血糖（Glu）共 20 个指标。

1.5.3 病理组织切片观察取4组大鼠肝组织用生理盐水洗净，纱布吸干，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，作病理切片，显微镜下观察形态学改变。

1.6 统计学处理

实验数据均采用SPSS17.0统计软件进行分析，所有数据以均值±标准差（±s）表示，组间采用单因素方差分析，采用LSD-t检验进行组间两两比较。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 急性毒性实验

一次性口服给药LPTA最大剂量达到5000 mg·kg-1时，7 d内给药组小鼠均未出现中毒死亡现象。与对照组相比，72 h内给药组小鼠精神状态明显下降，日常活动量显著减少，表现为嗜睡、闭眼、食欲减少、弓背。72 h后观察，给药组小鼠逐步恢复正常生活，饮食正常，活动量增加，直至7 d后观察发现给药组小鼠日常活动、精神状态、饮食进水量与对照组小鼠相比均无差异，可推断7 d后LPTA对小鼠正常生活无影响。因此，可推断小鼠对LPTA的最大耐受量可达到5000 mg·kg-1。

供给情况：国产钾方面，盐湖装置正常运作，厂家库存维持低位；青海盐湖上调11月报价，基准产品60%晶粉到站价上调50元/吨至2400元/吨，恢复返利政策50元/吨。进口钾方面，到船量仍较少，大合同货源预计11月中下旬开始到货；港口钾库存降至160万吨左右，62%俄白钾主流报价降至2480-2500元/吨。边贸钾方面，库存一般，到货量略增，但可售现货仍较少，62%俄白钾报价维持在2250-2300元/吨。

2.2 长期毒性实验

2.2.1 大鼠血清生化检测结果

（1）LPTA对大鼠血清肝脏生化指标的影响

连续服用莲子心总生物碱提取物30天后，不同剂量组的血清肝脏生化指标与对照组相比，均无显著性差异（P＞0.05）。 见表 1。

表1 莲子心总生物碱对大鼠血清肝脏生化指标的影响（n=10，±s）

表1 莲子心总生物碱对大鼠血清肝脏生化指标的影响（n=10，±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05

组 别对照组ALT/U·L-1 34.30±1.26 ALP/U·L-1 149.60±4.69 TBIL/μmol·L-1CHE/U·L-1 0.33±0.031001.00±23.72 TP/g·L-1 55.00±0.84 ALB/g·L-1 34.01±0.52 GLB/g·L-1 21.36±0.36 400 mg·kg-135.10±0.96150.20±6.180.28±0.041010.80±31.3257.08±0.7635.01±0.6222.42±0.59 LPTA 200 mg·kg-131.40±1.87157.70±6.780.30±0.041048.10±33.7856.91±0.6834.59±0.4021.59±0.57 100 mg·kg-1 F P 33.25±0.69 1.68 0.19 144.30±6.35 0.83 0.49 0.32±0.03 0.37 0.77 971.20±13.95 1.33 0.28 55.88±1.07 1.29 0.29 35.25±0.28 0.95 0.43 22.96±0.83 1.47 0.24

（2）LPTA对大鼠血清肾脏生化指标和无机离子的影响

连续服用LPTA 30 d后，SD大鼠的血清尿素氮含量显著低于对照组含量（P＜0.05），但未呈现剂量依赖型。其余肾脏生化指标与对照组相比无统计学意义（P＞0.05）。 见表 2。

（3）LPTA对大鼠血清心肌损伤生化指标的影响

SD大鼠血清心肌损伤常见指标见表3，高剂量组和中剂量组SD大鼠血清CK含量明显低于对照组（P＜0.05）。

（4）LPTA对大鼠血脂和血糖的影响

口服400、200 mg·kg-1LPTA的高、中剂量组SD大鼠血糖含量明显低于对照组，且具有剂量依赖性（P＜0.05）。 见表 4。

2.2.2 LPTA对大鼠肝组织形态学影响莲子总生物碱提取物对大鼠肝脏组织病理学的影响见图1。对照组大鼠肝组织病理切片中可明显观察到清晰可见呈发射状的中央静脉，染成蓝色的细胞核形态清晰完整。与对照组（图1-A）相比，低剂量（图1-B）和中剂量（图1-C）组肝组织病理学形态未观察到明显变化，高剂量（图1-D）与前3组相比，细胞核数目减少，肝细胞无明显肿胀，肝小叶结构正常。

表2 莲子心总生物碱对大鼠血清肾脏生化指标和无机离子的影响（n=10，±s）

表2 莲子心总生物碱对大鼠血清肾脏生化指标和无机离子的影响（n=10，±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05

组 别对照组400 mg·kg-1 BUN/mmol·L-1 5.12±0.18 4.57±0.07*Cr/μmol·L-1 24.90±1.40 26.40±0.79 Ca2+/mmol·L-1 2.57±0.04 2.65±0.03 Na+/mmol·L-1 141.00±0.42 143.10±0.53 K+/mmol·L-1 4.87±0.09 4.51±0.21 LPTA 200 mg·kg-14.64±0.12*26.00±0.802.65±0.02142.20±0.394.94±0.14 100 mg·kg-1 F P 4.66±0.33*3.54 0.02 25.10±0.71 0.55 0.65 2.63±0.03 1.60 0.21 141.90±0.60 3.09 0.14 4.54±0.10 2.32 0.09

表3 莲子心总生物碱对大鼠血清心肌损伤生化指标的影响（n=10，±s）

表3 莲子心总生物碱对大鼠血清心肌损伤生化指标的影响（n=10，±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05

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3 讨 论

生物碱在自然界中广泛分布，由于其结构多样，具有丰富的生理和药理活性。但同时，部分生物碱的毒性作用使其在临床上的应用受到限制。本研究从新鲜莲子心中提取总生物碱，100 g生药可得到2.67 g总生物碱，提取率为2.67%。

表4 莲子心总生物碱对大鼠血脂和血糖的影响（n=10，±s）

表4 莲子心总生物碱对大鼠血脂和血糖的影响（n=10，±s）

注：与对照组相比，*P＜0.05

组 别TCH/mmol·L-1TG/mmol·L-1HDL/mmol·L-1LDL/mmol·L-1Glu/mmol·L-1 0.57±0.06 0.16±0.01 10.46±0.56 1.53±0.09 0.37±0.06 0.56±0.05 0.16±0.02 8.17±0.32*1.52±0.16 0.36±0.08 0.55±0.10 0.15±0.01 8.90±0.58*1.52±0.07 0.38±0.08 0.56±0.04 0.13±0.01 9.83±0.49 F 0.22 0.16 0.07 1.31 4.09 P 0.88 0.92 0.97 0.29 0.01对照组1.63±0.090.38±0.12 LPTA 400 mg·kg-1 200 mg·kg-1 100 mg·kg-1

图1 莲子心总生物碱对大鼠肝组织形态学影响（H ＆ E染色，×100倍）

本研究结果显示，莲子心总生物碱的急性毒性试验中，口服莲子心总生物碱剂量高达5000 mg·kg-1均未出现口服毒性，在密切观察的7 d内，莲子心总生物碱未引起任何与治疗相关的中毒症状或者出现小鼠死亡例数。口服5000 mg·kg-1莲子心总生物碱的小鼠在72 h内出现较对照组小鼠行动迟缓以及嗜睡等症状，推测其可能原因为一次性给药体积大以及给药浓度的增加，对小鼠的日常活动造成影响，且莲子心总生物碱味苦，影响小鼠的正常饮食，但在72 h后给药组小鼠行动恢复正常，7 d后给药组小鼠与对照组小鼠行为活动等方面已无明显差异，可能与莲子心总生物碱在小鼠体内的排泄或代谢较快相关[4]。由于莲子心总生物碱不溶于水而溶于有机溶剂的性质，以及小鼠口服0.3%CMC-Na半数致死率（LD50）可达 27 g·kg-1[5]，说明本研究采用0.3%CMC-Na作为溶媒具有安全性。因此，小鼠对莲子心总生物碱的LD50要大于5000 mg·kg-1，本研究检测其最大给药耐受量为5000 mg·kg-1。

为进一步探讨莲子心总生物碱连续给药产生的毒性反应，采用 30 d 连续给药，以 400、200、100 mg·kg-1·d-1作为不同剂量组考察莲子心总生物碱与血清生化指标间的量效关系。结果表明，在连续30 d的口服毒性试验中，4组大鼠均未观察到与莲子心总生物碱相关的中毒症状以及死亡例数。为避免单一因素对实验结果造成偶然误差，本研究在评价莲子心总生物碱对大鼠肝脏活性的影响时，同时检测了7项临床常用生化指标。研究结果表明，4组大鼠血清 ALT、ALP、TBIL、CHE、TP、ALB、GLB 含量变化无统计学意义（P＞0.05），说明莲子心总生物碱对肝脏生化指标不造成影响。连续口服莲子心总生物碱30 d，给药组大鼠BUN含量相对于对照组显著性降低（P≤0.05），但这些差异并不是由于莲子心总生物碱相关的病理学改变而引起，而且4组大鼠检测结果均在SD大鼠血清BUN正常值变动范围内[6]，Cr、Ca2+、Na+、K+均无显著性差异，说明莲子心总生物碱对大鼠肾脏和无机离子活性无影响。本研究结果显示 400、200 mg·kg-1·d-1的莲子心总生物碱使 SD 大鼠血清中CK、Glu含量显著性降低，推测莲子心总生物碱具有良好的抗心律失常作用，以及抑制脂肪形成而与抗肥胖作用相关[7]，但数据变动均在实验值正常范围内。其余指标包括AST、LDH、TCH、TG、HDL、LDL在4组大鼠间比较均无显著性差异。

根据SD大鼠肝脏组织病理切片结果可客观地反映出莲子心总生物碱对大鼠脏器无毒副作用。因此，口服莲子心总生物碱对SD大鼠无毒副作用，并且剂量可高达 400 mg·kg-1·d-1。

综上所述，长期口服剂量高达400 mg·kg-1·d-1莲子心总生物碱不会导致血清生化指标的异常，也不会引起内脏器官不正常的病理变化。因此，本研究可在一定程度上证明莲子心总生物碱的安全性，为其今后更广泛地应用提供理论依据。

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