聚酰胺树脂纯化银杏总内酯的工艺研究*

李雪峰 ，徐振秋 ，刘俊超 ，王 雪 ，刘莉莉 ，杨绪芳 ，萧 伟 **江苏康缘药业股份有限公司，连云港 00；中药制药过程新技术国家重点实验室，连云港 00

银杏（Ginkgo biloba L.）为银杏科银杏属植物，为落叶高大乔木，仅在我国幸存，被达尔文称为“活化石”[1]。银杏内酯独特的生理作用和治疗价值已引起世界范围医疗行业的极大兴趣。国内外学者已发现银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J， 均为血小板活化因子 （platelet activating factor，PAF）拮抗剂，白果内酯可用于治疗脱髓鞘脑脊髓和神经疾病[2]。聚酰胺是一种价廉易得的化工原料，具有使用范围广、使用寿命长、分离效果好、实验操作简单等特点，广泛用于天然产物中有机物和某些金属元素的富集分离[3]。目前文献报道的提取纯化银杏内酯方法主要是采用有机溶剂多级萃取、结晶或反复柱色谱分离[4]，存在着工艺繁琐和生产成本高等问题。本实验采用聚酰胺树脂对银杏叶提取物中的银杏总内酯进行分离纯化，该方法具有操作简单，生产成本低，适合于产业化生产等特点。

1 仪器与材料

Sorvall RC6 Plus高速离心机 （上海安亭科学仪器厂）；CL-2磁力加热搅拌器 （巩义市予华仪器有限责任公司）。

银杏叶提取物（银杏内酯含量7.4%，徐州技源天然保健品公司）；聚酰胺树脂（西安蓝深特种树脂有限公司）。白果内酯，银杏内酯A、B、C对照品（中国食品药品检定研究院，批号依次为1108656-200605、110862-201310、110863-201209、110864-200906）；甲醇为色谱纯；氢氧化钠、醋酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 聚酰胺树脂预处理

聚酰胺树脂用95%乙醇浸泡48 h，纯化水洗至无醇味，再用1%NaOH浸泡24 h，滤掉碱液，纯化水洗至中性，用4倍量10%醋酸浸泡24 h，纯化水洗至中性并浸泡备用。

2.2 银杏总内酯含量测定方法[5]

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：30℃；以甲醇-四氢呋喃-水（23∶10∶75）为流动相；流速：1.0 mL·min-1；蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备：精密称取白果内酯、银杏内酯A、B、C对照品，加少量甲醇使溶解，制成每毫升含 1.6、1.0、0.6、0.8 mg的混合溶液，作为对照品溶液。

标准曲线的绘制：精密吸取混合对照品溶液1、2、4、6、8 mL，分别于 10 mL 量瓶中，流动相定容至刻度。取10 μL注入色谱仪中，测定峰面积，以峰面积对数为纵坐标与质量浓度对数为横坐标的回归方程为：白果内酯：Y=1.563X+1.773，r=0.9996；银杏内酯A：Y=1.5831X+1.733，r=0.9999；银杏内酯 B：Y=1.511X+1.639，r=0.9997； 银杏内酯 C：Y=1.5872X+1.7425，r=0.9995。结果表明，白果内酯，银杏内酯A、B、C 分别在进样量 1.6～12.8 μg、1.0～8.0 μg、0.6～4.8 μg、0.8～6.4 μg、0.6～4.8 μg 范围内呈良好的线性关系。HPLC-ELSD色谱图见图1。

2.3 银杏总内酯的提取

取银杏叶提取物，加水搅拌溶解、离心，减压浓缩至密度1.05 g·mL-1，得银杏总内酯溶液，HPLC法测定银杏总内酯含量为18.0 mg·g-1，备用。

2.4 树脂筛选[6]

2.4.1 吸附率考察准确称取预处理好的30～60目与60～90目聚酰胺树脂各20 g，分别加入银杏总内酯溶液40 g，室温放置，每隔30 min搅拌吸附5 min，持续3 h，过滤，集滤液，HPLC法测定其中银杏总内酯含量，计算吸附率。结果见图2。

吸附率=（初始液浓度-吸附后剩余溶液浓度）×100%/初始液浓度

2.4.2 解吸率考察将“2.4.1”项下吸附饱和的树脂分别加入200 mL纯化水，每隔30 min搅拌吸附5 min，持续3 h，过滤，集滤液。测定银杏总内酯含量，计算解吸率。结果见图2。

图2 不同树脂对银杏总内酯的吸附作用

解吸率=洗脱液浓度/（初始液浓度-吸附后剩余溶液浓度）×100%

结果两种树脂的吸附与解吸无明显差异，结合生产成本选用30～60目聚酰胺树脂进行纯化。

2.5 洗脱溶剂选择

取处理好的30～60目聚酰胺树脂20 g，取银杏总内酯溶液40 g上样，平行5份进行样品吸附后，分别用纯化水、10%、20%、30%、50%乙醇溶液200 mL进行洗脱，收集洗脱液，测定银杏总内酯含量计算洗脱率，见表1。

表1 不同洗脱溶剂对银杏总内酯的洗脱率和含量的影响（n=4）

洗脱率%=洗脱液中银杏总内酯的总量（g）/上样液中银杏总内酯的总量（g）×100%

结果显示，10%、20%、30%、50%乙醇洗脱剂洗脱时杂质较多，故选择纯化水作为洗脱溶剂。

2.6 径高比考察

取处理好的30～60目聚酰胺树脂3份，每份40g，分别装于径高比为 1∶4、1∶6、1∶8 的玻璃层析柱中。 分别注入银杏总内酯溶液，纯化水洗脱，收集洗脱液，测定银杏总内酯含量，考察径高比对吸附性能的影响，见图3。

图3 不同径高比对树脂吸附的影响

结果径高比1∶4时洗脱液中杂质含量较高，影响纯度；径高比1∶6与1∶8时对树脂的吸附洗脱无明显差异，结合生产实际选1∶6径高比进行分离与纯化。

2.7 上样药液浓度考察

流速不变，选择最大浓度18.0 mg·g-1的银杏总内酯溶液，再适当降低其浓度，每一柱体积（V=127 cm3）采集样品一次，测定样品中银杏总内酯含量，见图4-A。结果表明，上样药液浓度对树脂吸附洗脱无明显差异，选择上样药液浓度18.0 mg·g-1。

2.8 上样量考察

取银杏总内酯溶液，注入处理好的聚酰胺树脂柱（V=127 cm3），每上样10 g收集1次，收集 7份，测定洗脱液中银杏总内酯含量，由图4-B可见上样量30 g以后开始泄漏。柱体积127 cm3时，上样量不高于30 g。

2.9 上样吸附流速考察

将银杏总内酯溶液20 g分别以1.0、2.0、4.0 mL·min-1流速通过树脂柱，分段收集洗脱液，每管收集一个柱体积，测定流出液中银杏总内酯的含量，见图4-C。

结果表明，吸附流速对内酯洗脱无影响，将上样吸附流速控制在2.0～4.0 mL·min-1。

2.10 洗脱工艺研究

2.10.1 洗脱流速考察考察不同流速1.0、2.0、4.0 mL·min-1对洗脱率的影响。由表2可见洗脱剂流速对树脂洗脱无明显差异，选择洗脱剂流速为2.0～4.0 mL·min-1。

表2 洗脱流速对洗脱率的影响

图4 不同状态的银杏总内酯吸附曲线

2.10.2 水洗脱分布考察取银杏总内酯溶液1 kg（含总内酯18.0 g）注入处理好的聚酰胺柱（V=4710 cm3），纯化水洗脱，分段收集洗脱液，测定银杏总内酯含量，结果见表3。

表4 银杏总内酯的分离与纯化工艺研究工艺验证

表3 水洗脱分布工艺考察

结果流份1、5的洗脱液中总内酯含量较低，杂质较多，该流份不作为收集流份。

3 工艺验证

根据以上实验结果拟定最佳工艺：选择30～60目聚酰胺树脂，最大上样提取物质量与柱体积比1∶50，洗脱溶剂为纯化水，径高比1∶6，洗脱流速2.0～4.0mL·min-1，洗脱量2.5倍柱体积，进行3批放大工艺验证实验。洗脱液分别浓缩，减压干燥，称重，计算总固形物收率并测定其银杏总内酯含量。收率与洗脱率均比较稳定，说明该分离与纯化工艺可行。结果见表4。

收率%=纯化后得到的银杏总内酯原料重量（g）/银杏叶提取物投入重量（g）×100%

4 讨 论

由于聚酰胺对银杏总内酯吸附较弱，对黄酮类、鞣质等吸附较强，故利用聚酰胺树脂的吸附特性完成银杏总内酯的纯化。本文采用水溶解银杏叶提取物，选择聚酰胺进行吸附，纯化水除杂、洗脱，具有成本低、易操作、环保等特点，经3批实验验证其纯化工艺可行。

[1]徐艳芬，张丽娟，宋新波.银杏叶提取物的研究进展[J].药物评价研究，2010，33（6）：452-6.

[2]徐世民，张志鹏，王继峰.银杏叶活性成分的提取制备及质量标准、测定方法的研究进展[J].世界科学技术—中药现代化，2001，3（6）：33-6.

[3]张鹤鸣，王宁生.银杏萜内酯的化学性质及合成[J].广州中医药大学学报，2000，17（3）：266-70.

[4]叶 敏，果德安.银杏萜内酯的研究概况[J].世界科学技术－中医药现代化，2003，5（1）：33-8.

[5]乔 蓉，钟世安，邓潇君，等.聚酰胺树脂纯化荷叶碱的工艺研究[J]. 化学与生物工程，2008，25（5）：35-8.

[6]刘俊苹，睢玉祥，闫桂琴.聚酰胺分离纯化翅果油树叶黄酮工艺研究[J]. 西北农业学报，2012，21（1）：202-6.