一种可口服使用的壳聚糖季铵盐－紫杉醇纳米粒研制

贺 睿，唐 翠，印春华

（复旦大学 生命科学学院，上海 200438）

口服给药具有使用方便、患者顺应性良好、成本低廉等优势，是一种优选的给药方式［1－2］.然而，常用的抗肿瘤化疗药物多属于生物药剂学分类中的Ⅳ类药物（低溶解度、低渗透性药物），诸多问题限制其口服使用［3］.紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一种有效的广谱抗肿瘤药物，对乳腺癌、卵巢癌、非小细胞性肿瘤等多种实体瘤具有显著的疗效.但PTX 溶解度低，小肠渗透性差，易受到肠上皮细胞表面P－糖蛋白（Pgp）介导的药物外排及细胞色素P450依赖的药物代谢，口服生物利用度小于10%［1，4］.为解决上述问题，国内外学者研究了多种药物递送系统以提高PTX 的口服生物利用度，其中可自组装的聚合物－药物连接物因其可改善难溶性药物的溶解度、控制药物释放、通过口服生理屏障等优点而引起广泛关注［2，4－5］.阳离子聚合物壳聚糖季铵盐（N－Trimethyl Chitosan，TMC）生理条件下溶解性好，黏膜黏附性强，可促进小肠转运和吸收，是一种优良的口服递送载体材料.Yin等［6］研究表明分子质量为30ku和200ku，季铵化度为30%的TMC可显著提高胰岛素的小肠转运能力，从而实现其有效口服递送.另外，TMC 含有活性氨基基团，可作为药物的连接位点，制得聚合物－药物连接物.

本文结合了TMC及聚合物－药物连接物的优势，设计并制备了TMC－PTX 纳米粒（TP NPs），用于口服递送PTX.制备分子质量分别为30ku和200ku，季铵化度为30%的TMC，以琥珀酸为连接基团共价连接TMC和PTX，制得聚合物－药物连接物TP，TP在水中可自组装形成TP NPs.研究TP NPs的理化性质、载药与释药、黏膜黏附和促渗透作用.

1 方 法

1.1 材料和动物

壳聚糖，脱乙酰度85%，分子质量分别为30ku和200ku，购自浙江金壳生物化学有限公司；PTX 购自四川西昌制药厂；1－（3－二甲氨基丙基）－3－乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）购自上海源聚生物科技有限公司；N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自上海源聚生物科技有限公司；罗丹明B（RhB）购自上海国药集团化学试剂公司；其他试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水.SD 大鼠，雄性，体重（200±20）g，购自复旦大学实验动物中心.

1.2 TP的制备与表征

参照文献［7］方法制备琥珀酰PTX（PTX－suc）.参照Yin 等［6］方法，以30ku 和200ku 壳聚糖制备TMC.称取PTX－suc、NHS和EDC·HCl至高型称量瓶，PTX－suc∶NHS∶EDC·HCl摩尔比为1∶5∶5，加入二甲基亚砜（DMSO）溶解，PTX－suc浓度为1mg／mL，搅拌1h；加入10mg／mL TMC 水溶液，PTX－suc与TMC质量比为1∶5，搅拌12h；以水透析3d（MWCO 3 500u），冷冻干燥.产物以TP（x）命名，其中x 表示壳聚糖分子质量（ku）.

以氘水为TMC的溶剂，氘水、氘代DMSO 和氘代三氟乙酸混合液为TP的溶剂，四甲基硅烷（TMS）为内标，AVANCE DMX500型核磁共振仪常温测定样品的核磁共振（1H NMR）图谱.

1.3 粒径、Zeta电势及形态

两亲性TP分散于水中可自组装形成TP纳米粒（TP NPs），Zetasizer Nano－ZS型电位及粒度测定仪测定TP NPs的粒径和Zeta电势.取TP NPs溶液，滴至云母片上，室温自然干燥，黏于铜台，喷金，扫描电镜（SEM）观察其形态.

1.4 临界胶束浓度（CMC）

配制1mg／mL TP NPs溶液，稀释至不同浓度（0.001～0.4mg／mL）.量取10μL芘的甲醇溶液（6.0×10－4mol／L），置10mL试管中，吹干.分别量取1mL 上述不同浓度的TP NPs溶液，加至吹干的试管中，超声1h.发射波长为390nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm，酶标仪测定各样品激发光谱.以激发波长为335nm 和333nm 处荧光强度的比值I335／I333对lg［C／（mg·mL－1）］作图，计算TP NPs的CMC.

1.5 载药量和体外释放

参照文献［8］方法，精密称取1mg PTX，置10mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，制得100μg／mL PTX 甲醇溶液；分别精密量取0.2，0.4，0.6，1，1.5，2mL，置10mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得浓度分别为2，4，6，10，15，20μg／mL的PTX 标准溶液，测定227nm 处吸光值，以吸光值对PTX 浓度进行线性回归，制得PTX 标准曲线.配制100μg／mL TP，测定227nm 处吸光值，根据标准曲线计算载药量.

适量TP 分散于水中，制得4 mg／mL TP NPs 溶液，取4 mL TP NPs溶液至透析袋（MWCO 3 500u），以100mL 含0.1%（质量浓度）Tween 80的pH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）为释放介质，37℃、100r／min振荡温育；分别于设定时间取样0.5 mL，补加0.5 mL 释放介质；样品12 000r／min 离心10min，高效液相色谱法（HPLC）测定PTX 浓度，计算累计释放量.色谱条件：色谱柱Hypersil ODS2柱（中国科学院大连化学物理研究所，200×4.6mm，5μm）；流动相为52∶48（体积比）的乙腈∶水；流速为1mL／min；检测波长为227nm；进样量为20μL.

1.6 在体小肠黏附

称取3mg RhB，加1mL pH 4.5HCl溶液溶解，加1.5mg NHS和3mg EDC·HCl，避光搅拌1h；称取0.3g TMC，加9 mL 水溶解，加至RhB 体系中，避光搅拌24h；反应液以水透析3d（MWCO 3 500u），冷冻干燥，得RhB标记的TMC.以RhB标记的TMC替代TMC，按1.2项下方法制备RhB标记的TP NPs.

SD 大鼠，禁食12h，可自由饮水，麻醉后沿腹中线打开腹腔，取约10cm 回肠肠段，生理盐水冲洗至净，两端用手术线结扎成封闭肠环，肠环中注入1mL RhB标记的TMC或TP NPs（1mg／mL）溶液；将肠段放回腹腔，2h后处死大鼠，剪开肠环收集肠液，加生理盐水冲洗肠段，合并肠液和冲洗液，酶标仪测定RhB标记的TMC或TP NPs含量（λex＝560nm，λem＝590nm）.

1.7 小肠离体转运

PTX 溶液配制：以聚氧乙烯蓖麻油／无水乙醇（1∶1，体积比）配制1mg／mL PTX 贮备液，使用时以Kreb's－Ringer缓冲液稀释至100μg／mL；PTX／TMC混合液配制：配制10mg／mL TMC溶液，使用时将PTX 贮备液、TMC溶液和Kreb's－Ringer缓冲液按1∶1∶8（体积比）混合.

SD 大鼠，禁食12h，可自由饮水.颈椎脱臼处死，沿腹中线打开腹腔取出回肠，以Kreb's－Ringer缓冲液清洗干净，剪成约7cm 长，两端约1cm 处用手术线结扎形成封闭肠环，肠环内分别注入0.5mL PTX溶液、PTX／TMC混合液、TP NPs溶液（浓度按PTX 计均为100μg／mL）.肠环置高型称量瓶中，加入5mL 37℃氧气饱和的Kreb's－Ringer缓冲液，使肠环保持拉伸状态，37℃、100r／min振荡温育.分别于30，60，90，120，180min取样200μL，补加37℃Kreb's－Ringer缓冲液200μL.样品12 000r／min离心15min，按1.5项下HPLC法测定样品中PTX 含量，计算PTX 的表观渗透系数（Papp）.

2 结果与讨论

2.1 TP的制备与表征

图1为TP和TP NPs的合成路线.以二氯甲烷为溶剂，琥珀酸酐以吡啶催化开环，与PTX 的2'位羟基发生酯化反应，真空干燥得PTX－suc.采用分子质量分别为30ku和200ku的壳聚糖与碘甲烷反应合成了TMC.TMC与PTX－suc在DMSO／水混合溶剂中经EDC／NHS催化缩合制得TP.TP含有亲水性聚合物和疏水性药物，水中可自组装形成纳米粒.图2为TMC 和TP的1H NMR 图谱.经1H NMR 图谱计算TMC的季铵化度约为30%［9］，TP的1H NMR 图谱中7.3×10－6～8.0×10－6和3.1×10－6～4.0×10－6的信号峰分别为PTX 苯环和壳聚糖糖环上的质子峰，表明PTX 已连接至TMC上，制得聚合物－药物连接物TP.

图1 TP和TP NPs的合成路线Fig.1 Synthetic route of TP and TP NPs

2.2 粒径、Zeta电势及形貌

TP（30）NPs和TP（200）NPs水中平均粒径分别为（166.2±10.8）nm 和（193.7±15.1）nm，Zeta电势分别为（31.6±1.9）mV和（32.1±2.0）mV.图3（a）和（b）分别为TP（30）NPs和TP（200）NPs的SEM 图，可见纳米粒近似球形，表面光滑，粒径为100～200nm，粒径分布均匀且分散性较好.如图3（c）和（d）所示，模拟胃肠道环境的不同pH 条件下，TP NPs粒径无显著变化，表明TP NPs可在胃肠道环境中保持纳米结构的稳定性.采用荧光探针芘，测定两亲性聚合物的CMC.图3（e）和（f）为I335／I333对lg C 线性回归，I335／I333变化的转折点所对应的浓度即为CMC［10］.TP（30）NPs和TP（200）NPs的CMC较小，分别为0.065和0.039mg／mL，表明TP NPs在生理环境中经稀释后也可较好的保持粒子状态.

图2 TMC和TP的1 H NMR 图谱Fig.2 1 H NMR spectra of TMC and TP

图3 TP（30）NPs（a）和TP（200）NPs（b）的SEM 图；pH 1.2，5.0，6.8和7.4下TP（30）NPs（c）和TP（200）NPs（d）的粒径（n＝3）；TP（30）NPs（e）和TP（200）NPs（f）的I335／I333对lg［C／（mg·mL－1）］线性回归Fig.3 SEM images of TP（30）NPs（a）and TP（200）NPs（b）；Particle sizes of TP（30）NPs（c）and TP（200）NPs（d）at pH 1.2，5.0，6.8，and 7.4.Indicated values were mean±SD（n＝3）；Variation of intensity ratio（I335／I333）versus logarithmic concentrations of TP（30）NPs（e）and TP（200）NPs（f）

2.3 载药量与体外释放

TP（30）NPs和TP（200）NPs的载药量分别为11.0%和11.1%（质量分数）.图4为TP NPs在0.2mol／L pH 7.4PBS中的PTX 释放曲线.药物物理包埋于纳米粒后的释药行为一般包括初期突释和后期缓释，而自组装的聚合物－药物连接物TP NPs需将药物化学连接键水解后方可释放PTX 至介质中，故无明显突释，可持续缓慢释放药物达10d.PTX 释放速率随聚合物分子质量的增大而减小，这是由于分子链较长的TP 可使释放介质黏度增加，且形成的纳米粒缠绕较紧密［6，11］.

图4 TP NPs在pH 7.4PBS中的PTX 释放曲线Fig.4 In vitro PTX release profiles from TP NPs in pH 7.4PBS

2.4 在体小肠黏附与小肠离体转运

图5（a）为TP NPs的在体小肠黏附率，可见TP（30）NPs和TP（200）NPs的小肠黏附率分别为相应TMC的1.9和2.0倍.TMC 荷正电，可与小肠黏膜表面荷负电的黏蛋白静电吸附富集于黏液层；TMC与PTX 连接后，疏水性增强，可与黏膜黏蛋白和小肠上皮细胞经疏水作用结合，故小肠黏附力提高［2］.图5（b）为PTX、PTX／TMC和TP NPs在离体小肠中的Papp，可见，TP（30）NPs和TP（200）NPs均可显著促进PTX 的小肠转运，Papp分别为游离PTX 的13.1 和6.1 倍.TP NPs的促渗透作用可能归因于：（1）TP NPs荷正电，可与小肠上皮细胞紧密连接处的荷负电类脂质作用，打开紧密连接，从而促进PTX经胞间途径转运［12］；（2）TP NPs可同时经静电作用和疏水作用黏附至细胞膜，被小肠上皮细胞摄取后经胞内途径转运［13］；（3）PTX 是P－gp的底物，PTX 连接至TMC并形成纳米粒，可避免被小肠上皮细胞Pgp药物流出泵排出，提高PTX 的转运效率［3］.TP（200）NPs的促渗透作用弱于TP（30）NPs，这可能是由于TP（200）NPs分子链过长，穿透上皮细胞层的能力减弱，故小肠转运能力降低［6］.分子质量为30ku和200ku的TMC溶液分别与PTX 物理混合，PTX／TMC组的Papp分别为游离PTX 的1.8和3.6倍，这是由于物理混合液中TMC可打开小肠紧密连接促进游离PTX 的小肠转运.

图5 （a）TMC和TP NPs的在体小肠黏附率；（b）PTX、PTX／TMC和TP NPs在离体小肠中的PappFig.5 （a）Mucoadhesion of TMC and TP NPs；（b）Pappof PTX in excised rat ileum

3 结论

设计并合成用于口服递送PTX 的聚合物－药物连接物TP，TP 在水中可自组装形成平均粒径小于200nm 且粒径均一的TP NPs，模拟胃肠道环境的不同pH 条件下粒径稳定；TP NPs在pH 7.4PBS中可持续缓慢释放药物达10d；TP NPs小肠黏膜黏附力强，可通过打开小肠上皮细胞紧密连接、促进上皮细胞摄取等发挥促渗透作用.因此，可自组装的TP NPs有望在肿瘤治疗中用于口服递送化疗药物.

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