长江南京段水体中7种苯胺类化合物的检测方法及生态风险评价

张圣虎，许晶晶，2，刘济宁，吴晟旻，石利利*（.环境保护部南京环境科学研究所，江苏 南京 20042；2.南京工业大学理学院，江苏 南京 20009）

长江南京段水体中7种苯胺类化合物的检测方法及生态风险评价

张圣虎1，许晶晶1，2，刘济宁1，吴晟旻1，石利利1*（1.环境保护部南京环境科学研究所，江苏 南京 210042；2.南京工业大学理学院，江苏 南京 210009）

应用固相萃取结合高效液相色谱-串联质谱法，建立了同时测定环境水样中7种苯胺类化合物的检测方法.实验表明，以ZORBAX Eclipse Plus C18 （3.5μm，2.1×150mm）色谱柱为分离柱，乙腈-水（2mmol/L甲酸铵）为梯度洗脱的流动相，在电喷雾质谱正离子模式下，7min内可以分离目标化合物；在1～200μg/L浓度范围内，7种苯胺类化合物的峰面积与质量浓度的线性关系良好；添加水平分别为0.8、4.0、20.0μg/L时，目标化合物的平均回收率分别为68.5%～102.2%、71.4%～89.4%、62.0%～78.3%，相对标准偏差均小于6.9%；利用本方法对长江南京段平水期（2014.4）、丰水期（2014.8）和枯水期（2014.12）的14个采样点的环境水样进行检测，检出4-硝基苯胺、2，6-二乙基苯胺、3，4-二氯苯胺和4-异丙基苯胺4种苯胺类化合物，且4-硝基苯胺在3个时期14个采样点均能检出；风险商值法评估长江南京段水体中4-硝基苯胺的生态风险为低生态风险.

高效液相色谱-串联质谱；固相萃取；苯胺类化合物；环境水样

苯胺类化合物作为合成药物、染料、杀虫剂、高分子材料等的重要原料，被广泛应用于化工、印染和制药等工业.研究表明，苯胺类化合物对水生生物和人体具有一定的毒害作用［1-4］，能够影响组织细胞供氧造成内窒息，长期作用可能导致神经系统症状和血象变化，个别苯胺类化合物还具有三致效应和内分泌干扰效应［5-6］.目前，我国已将部分苯胺类化合物列为“水中优先控制污染物”［7］和化学品环境风险防控“十二五”规划中累积风险类重点防控化学品.因此，分析和测定环境水样中苯胺类化合物的暴露浓度，可为水环境污染控制提供理论支撑.

目前，国内外关于水中苯胺类化合物的测定方法还不多，并且目标化合物的种类也很少，采用方法包括气相色谱法（GC）［8-10］、气相色谱-串联质谱法（GC-MS）［11］、高效液相色谱法（HPLC）［12-14］、酶联免疫吸附法（ELISA）［15］、液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）［16］等.相对于其它分析方法，液相色谱-串联质谱法对苯胺类化合物的测定无需进行衍生化前处理，同时灵敏度高，选择性和特异性好，能对低浓度的地表水样品进行很好的定量分析检测.因此，本研究根据长江南京段周边化工园区生产和使用苯胺类化合物的调研情况，选取7种生产及使用量大的苯胺类化合物，拟建立环境水样中7种苯胺类化合物的HPLC-MS/MS检测方法，探讨长江南京段平水期、丰水期和枯水期的暴露浓度，并运用风险商值法进行初步风险评估，以期为长江南京段水体中苯胺类化合物的生态风险控制和水环境质量管理提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 研究区域

长江南京段自江宁铜井镇南至栖霞与句容交界的大道河，全长98km，平均水深13m.南岸上起江宁铜井镇与马鞍山市交浦口乌江镇与和县交界，下至六合龙袍镇与仪征市交界.

1.2 样品采集

分别于2014年4～12月在长江南京段（31°48'N～32°14'N，118°30'E～119°12'E）区域进行平水期（4月下旬）、丰水期（8月下旬）和枯水期（12月下旬）3次大范围的表层水体采样调查，共14个采样点（图1），采样深度约3m，水体平稳无波浪.使用有机玻璃采水器采集水样，每个样点采集3个平行样，共采集3～4L水样，装入棕色玻璃瓶中，在24h内富集萃取.

1.3 仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱仪（LC-Agilent Technologies 1290Infinity，MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美国AB公司）；ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（150mm×2.1mm，3.5μm）（美国Agilent公司）；MCX固相萃取小柱（150mg，6mL）（美国Waters公司）；HLB固相萃取小柱（200mg，6mL）（美国Waters公司）；PCX固相萃取小柱（200mg，6mL）（美国Agilent公司）；加速溶剂萃取仪（戴安中国有限公司）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）；Milli-Q超纯水器（美国Mimpore公司）；AG-285电子天平（瑞士Mettler公司）.

图1 长江南京段采样点分布Fig.1 Sampling sites of Yangtze River of Nanjing section

4-硝基苯胺（纯度99%）、2-氯-4-硝基苯胺（纯度98%）、4-异丙基苯胺（纯度99%）、2，6-二乙基苯胺（纯度98%）、3，4-二氯苯胺（纯度98%）、2，4-二氨基甲苯（纯度98%）、2，6-二甲基苯胺（纯度99%），以上化学品均购自百灵威科技有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；二氯甲烷、丙酮（色谱纯，美国TEDIA公司）；甲酸铵（色谱纯，美国ROE SCIENTIFIC公司）；实验用水为Milli-Q超纯水.

1.4 样品处理

取水样100mL过0.45μm玻璃纤维滤膜后，过MCX固相萃取小柱对苯胺类化合物进行富集.MCX固相萃取柱依次用10mL甲醇、10mL去离子水活化，控制水样以5mL/min流速通过小柱富集.水样全部通过后，采用4mL2%甲酸水溶液，流速为2mL/min锁定苯胺类物质；4mL 25%甲醇水溶液净化，在负压条件下抽真空30min进行干燥后，用2%氨水甲醇溶液，流速为1mL/min洗脱目标化合物，并定容至5mL，经0.22μm针式有机滤膜过滤后，置于进样瓶中待测.

1.5 仪器条件

1.5．1 液相色谱条件 采用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（150mm×2.1mm，3.5μm），流动相：2mmol/L甲酸铵水溶液（A）和乙腈（B），柱温40℃，进样量5μL.采用梯度洗脱进行样品分析，具体洗脱条件见表1.

1.5．2 质谱条件 采用电喷雾（ESI）离子源，正电离模式，多反应离子监测（MRM）扫描定量分析目标污染物.气帘气（CUR）压力为241318Pa，喷雾气（GS1）压力为379214Pa，辅助加热气（GS2）压力为413688Pa，源温度（TEM）为450℃，离子化电压（IS）为5500V，碰撞气（CAD）medium，碰撞能量（CE）、去簇电压（DP）、入口电压（EP）和出口电压（CXP）经实验优化见表2.

表1 梯度洗脱条件Table 1 Condition of Gradient elution

表2 目标化合物的质谱参数Table 2 Mass spectrometric conditions for target compounds

1.6 质量保证和控制（QA/QC）

目标化合物通过与标准样品的保留时间（2%以内）和选择离子的峰面积比例（20%以内）比较进行定性确认，并采用最高丰度或背景干扰最少的选择离子进行定量分析.每一组样品（10～15个）添加1个基质空白、1个样品重复和1个基质加标回收作为质量控制.方法空白中没有目标化合物检出.

1.7 生态风险评价方法

采用风险商值法（RQ）评估长江南京段水体中苯胺类化合物的生态风险等级.RQ 值为预测环境浓度（PEC）或实测环境浓度（MEC）与预测无效应浓度（PNEC）的比值.根据RQ 值大小，将环境风险等级分为3级，即RQ值在0.01～0.1间为低生态风险，在0.1～1.0间为中等生态风险，大于1为高生态风险［17］.基于上述分析方法（SPEHPLC/MS/MS），可测得长江南京段水体中苯胺类化合物的MEC值，并通过获得相应苯胺类化合物的PNEC值，即可依据RQ法判断生态风险等级.

2 结果与讨论

2.1 分析方法的优化

2.1．1 质谱条件的优化 根据目标化合物的分子结构特征，选择ESI正电离模式.采用半自动进样方式，以5μL/min的流速将500μg/L的标准工作储备液分别注入离子源；在MRM模式下对每种化合物进行一级质谱分析（Q1扫描），得到每种化合物的分子离子峰；选取相应母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析（Q2扫描），得到碎片离子信息；接着对目标化合物二级质谱的 CE、DP、EP、CXP等质谱参数进行优化，使目标化合物的分子离子与特征离子碎片的离子强度达到最大时为最优条件（表2）.

图2 目标化合物的HPLC-MRM谱图Fig.2 HPLC-MRM chromatogram of target compounds

2.1．2 色谱分离条件的优化 分别用乙腈-水、乙腈-水（2mmol/L甲酸铵）作为流动相，对7种目标化合物（0.5mg/L）的分离效果和峰形进行比较.结果发现，以乙腈-水为流动相只有部分目标化合物出峰，而当在水中加入2mmol/L甲酸铵显著改善目标化合物的响应值和峰形.由于待测化合物结构中都含有氨基，属于弱碱性物质，加入适量甲酸铵可以提高待测物离子化效率从而改变目标化合物的响应（图2）.因此，选择乙腈-水（2mmol/L甲酸铵）作为流动相.采用上述条件尽管不能将7种目标化合物全部完全分开，但由于采用了选择离子扫描模式（MRM），可避免待测物之间的相互干扰，并不影响准确定性与定量分析.

2.1．3 固相萃取柱的选择 比较了HLB、MCX和PCX固相萃取柱对苯胺类化合物的萃取效率（图3）.结果表明，HLB固相萃取柱对苯胺类化合物的回收率较低（1.1%～65.7%），而采用MCX和PCX固相萃取柱进行萃取时，对目标化合物都有较高的萃取率，均在60%以上，由于目标化合物属于碱性离子型化合物，阳离子交换柱适合碱性离子型化合物的富集和分离.但是比较两种固相萃取柱的萃取率，MCX固相萃取柱对5种苯胺类化合物的萃取率要高于PCX固相萃取柱对相应化合物的萃取率，因此，选用MCX固相萃取柱进行实际水样的萃取.

图3 三种固相萃取柱的萃取效率Fig.3 Extraction efficiencies of target compounds with three solid phase extraction columns

2.1．4 线性范围和检出限 准确吸取目标化合物混合标准样品，用甲醇/水（V/V=1/1）稀释成质量浓度为1，10，20，50，100，200μg/L的一系列标准工作溶液，在优化的液相色谱和质谱条件下进行分析检测.对20μg/L的标准工作溶液在1d内检测3次，计算日内精密度；对其每天检测1次，连续检测3d，根据结果计算日间精密度.以峰面积（Y）对质量浓度（X，μg/L）进行线性回归.各目标物在1～200μg/L范围内线性关系显著，结果如表3所示.与已有文献［16］中报道的检出限基本一致（如2，6-二甲基苯胺的检出限LOD=1.0μg/L）.

表3 目标化合物的标准曲线方程、相关系数、日内及日间精密度（n=3）、检出限及定量限Table 3 The linear equations， correlation coefficients， RSD （n=3）， LODs and LOQs of target compounds

表4 空白水样中目标化合物的回收率、相对标准偏差（RSD）Table 4 Recovery， RSD of target compounds in water samples

2.1．5 回收率和精密度 方法采用空白水样加标方式，在浓度水平分别为0.8，4，20μg/L的空白加标水样进行回收率测定，每个加标水样平行配制3份样品，按上述方法进行前处理和色谱分析，采用外标法定量，结果见表4.回收率和相对标准偏差均能满足样品分析要求.

2.2 长江南京段水体中苯胺类化合物浓度水平

2014年3次水样样品中共检测到4种苯胺类化合物：4-硝基苯胺、2，6-二乙基苯胺、3，4-二氯苯胺和4-异丙基苯胺（表5）.其中，4月份水样样品中检出的苯胺类化合物种类相对较多，共检出3种目标化合物，分别为4-硝基苯胺、2，6-二乙基苯胺和3，4-二氯苯胺，而且在长江南京段的14个采样点均有检出；8月份的水样样品中仅检测到4-硝基苯胺，12月份的水样样品中虽检测到4-硝基苯胺和4-异丙基苯胺两种苯胺类化合物，但是4-异丙基苯胺仅在3个采样点检出，一方面可能是由于降雨量相对增多，另一方面南京青奥会期间限制化工企业生产，在一定程度上都会降低长江南京段水体中苯胺类化合物的暴露水平.

4-硝基苯胺在14个采样点的3次采样样品中均能检出（表5），而且随着水温的升高（4月份17.6℃，8月份25.8℃，12月份13.1℃），水中暴露浓度会降低（4月份59.8ng/L，8月份31.4ng/L，12月份492.5ng/L）.此外，4-硝基苯胺暴露浓度在3次采样均呈现出以下规律，即A采样点（铜井河口）暴露浓度基本最低，B采样点（林山自动站）暴露浓度最高，而且按照采样点位置表现出逐渐降低的趋势，这表明在B采样点附近可能有持续的污染源.目前，4-硝基苯胺已经被列入环境优先污染物黑名单中，而且美国EPA和日本环保厅都已将其列入检测控制化合物中.因此，本研究对4-硝基苯胺在长江南京段水体中的生态风险进一步分析.

表5 4，8，12月长江南京段水样中目标化合物的测定含量Table 5 Concentrations of target compounds in the water samples of the Yangtze River in nanjing section in April，August and December （ng/L）

2.3 环境污染物的生态风险评估

生态风险评价（ERA）过程是定量预测环境危害对生态系统产生不利影响的概率及评估该危害的可接受程度的技术方法体系，是环境风险管理和决策的主要依据.生态风险评价的最终目的是得出浓度阈值或风险临界值，为制定相关标准或基准、采取生态风险控制措施提供技术支撑.

风险商（RQ）作为一种风险表征方法而被广泛使用，可定量化表征生态风险［18］.RQ值计算公式如下：

水环境中PNEC水值可由评估因子法推导而得，其中评估因子根据获得的急性与慢性毒性数据量及不同情况可以选择1000、100、50、10，见表6.4-硝基苯胺对水生生物的急性和慢性毒性数据见表7，因此，选择评估因子1000计算PNEC水.藻、溞、鱼的EC50/LC50最小值为25.0mg/L，除以评估因子1000，得到PNEC水为25.0μg/L.

本研究中采用“最大值”原则来评价长江南京段水体中4-硝基苯胺的生态风险，水环境中实测浓度（MEC）最大值为0.574μg/L，预测无效应浓度（PNEC）为25.0μg/L，RQ（0.02）在0.01～0.1间，为低生态风险.虽然污染程度较轻，但是研究表明硝基苯胺类化合物很难被生物降解［19］，极易产生对环境的累计污染，而长江作为南京重要的饮用水来源，仍会对人体造成较大的危害.

表6 推导PNEC水的评估因子Table 6 Assessment factors for derivation of PNECwater

表7 4-硝基苯胺对水生生物的急性和慢性毒性数据aTable 7 Acute and chronic toxicity data of 4-Nitroaniline for freshwater species

3 结论

3.1 建立了同时测定环境水体中7种苯胺类化合物暴露浓度的SPE-HPLC/MS/MS测试方法，方法稳定可靠，能够满足环境水体中7种苯胺类化合物暴露浓度的检测分析.

3.2 在长江南京段平水期（2014.4）、丰水期（2014.8）和枯水期（2014.12）的3次采样中，平水期的水样中检测到苯胺类化合物的种类最多；4-硝基苯胺在三次水样中均能检测到，且暴露浓度依次为枯水期＞平水期＞丰水期；生态风险评估表明4-硝基苯胺为低环境风险.

［1］Dom N， Knapen D， Benoot D， et al. Aquatic multi-species acute toxicity of （chlorinated） anilines： experimental versus predicted data ［J］. Chemosphere， 2010，81（2）：177-186.

［2］李志华，朱正丽，陆光华，等.2-氯苯酚与取代苯酚及苯胺类化合物对鲫鱼联合毒性效应的定量构效关系 ［J］. 河海大学学报（自然科学版）， 2012，40（2）：156-161.

［3］郑洪秀，于玲红，李玉梅，等.取代苯酚、苯胺类化合物对黄河水中藻类的急性毒性研究 ［J］. 内蒙古科技大学学报， 2008，27（6）：173-186.

［4］葛会林，刘树深，刘 芳.多组分苯胺类混合物对发光菌的抑制毒性 ［J］. 生态毒理学报， 2006，1（4）：295-302.

［5］芦 冉.3，4-二氯苯胺对雄性大鼠生殖系统的毒性效应 ［D］.北京：首都师范大学， 2008.

［6］International Agency for Research on Cancer. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. ［EB/Z］. http：//monographs. iarc. fr /ENG/Classification /2013-04-10.

［7］周文敏，傅德黔，孙宗光.水中优先控制污染物黑名单 ［J］. 中国环境监测， 1990，6（4）：1-3.

［8］Beatriz J S， Evaristo B， Mercedes G. Occurrence of aromatic amines and N-nitrosamines in the different steps of a drinking water treatment plant ［J］. Water Res.， 2012，46（14）：4543-4555.

［9］鲁 杰，杨大进，葛志亮，等.复合食品包装制品中有毒芳香胺-2，4-二氨基甲苯的检测技术的研究 ［J］. 中国卫生检验杂志，2007，17（10）：1743-1745.

［10］Kishan R N， Archana J， Krishna K. Liquid-phase microextraction and GC for the determination of primary， secondary and tertiary aromatic amines as their iodo-derivatives ［J］. Talanta， 2007，73（4）：684-691.

［11］Margarita Aznar， Elena Canellas， Cristina Nerín. Simultaneous determination of aliphatic and aromatic amines in water and sediment samples by ion-pair extraction and gas chromatography-mass spectrometry ［J］. J Chromatogr A.， 2009，1216（27）：5176-5181.

［12］徐水平，姜 焕.高效液相色谱法测定水中对（邻）硝基苯胺 ［J］.中国环境监测， 2003，19（3）：14-17.

［13］王 超，彭 涛，高愈霄，等.混合型固相萃取/超高压液相色谱法测定废水中苯胺类化合物 ［J］. 分析测试学报， 2013，32（12）：1415-1420.

［14］Tong C L， Guo Y， Liu W P. Simultaneous determination of five mitroaniline and dinitroaniline isomers in wastewaters by solidphase extraction and high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection ［J］. Chemosphere， 2010，81：430-435.

［15］彭方毅，何 苗，盛建武，等.水中硝基苯胺类化合物酶免疫化学分析技术研究 ［J］. 化学学报， 2007，65（22）：2563-2569.

［16］Margarita A， Elena C， Cristina N. Quantitative determination of 22primary aromatic amines by cation-exchange solid-phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry ［J］. Journal of Chromatography A， 2009，1216：5176-5181.

［17］Hernando M D， Mezcua M， Fernandez-Alba A R， et al. Environmental risk assessment of pharmaceutical residues in wasterwater effluents， surface waters and sediments ［J］. Talanta，2006，69（2）：334-342.

［18］汤薪瑶，左剑恶，余 忻，等.制药废水中头孢类抗生素残留检测方法及环境风险评估 ［J］. 中国环境科学， 2014，34（9）：2273-2278.

［19］Adrian S. High-rate biodegradation of 3- and 4-nitroaniline ［J］. Chemosphere， 1999，39（13）：2325-2346.

Analysis method and environmental risk assessment of 7aniline compounds of environmental water samples in Yangtze River of Nanjing section.

ZHANG Sheng-Hu1， XU Jing-Jing1，2， LIU Ji-Ning1， WU Sheng-min1， SHI Li-Li1*（1. Nanjing Institute of Environmental Sciences， Ministry of Environmental Protection， Nanjing 210042， China；2.Nanjing Tech University， Nanjing 210009， China）. China Environmental Science， 2015，35（10）：3135～3141

An analysis method based on solid phase extraction （SPE） coupled with liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry （LC-ESI-MS/MS） with positive ionization mode has been developed for measuring of seven aniline compounds in environmental water samples. The target compounds were separated on ZORBAX Eclipse Plus C18 （3.5μm，2.1×150mm） column with mobile phases containing acetonitrile and 2mmol/L aqueous ammonium formate. Analytes confirmations were performed using multiple reactions monitoring （MRM） and seven compounds were separated within 7min. The calibration curve was linear in the range 1～1000μg/L. Recovery experiments were performed using MCX extraction cartridge and concentrations varied from 0.8～20μg/L. The recovery rates for target compounds were in the range of 68.5%～102.2%， 71.4%～89.4%， 62.0%～78.3% （RSD ＜ 6.9%， n=3）， respectively. Base on the analysis method， the water samples in Yangtze River of Nanjing section at 14sampling site during the flow period （April， 2014），the wet period （August， 2014） and the dry period （December， 2014） were analysed. Four target compounds， including 4-Nitroaniline， 2，6-diethyl-Benzenamine， 3，4-Dichloroaniline and 4-Isopropylaniline， were determined in the water， while 4-Nitroaniline was all determined at 14sampling site during the flow period， the wet period and the dry period. Risk quotient method was utilized to evaluate the environmental risks for 4-Nitroaniline， and the results was low risk levels.

HPLC-MS/MS；solid phase extraction；aniline compounds；environmental water samples

X522

A

100-6923（2015）10-3135-07

张圣虎（1984-），男，山东菏泽人，助理研究员，博士，主要从事环境污染物暴露评估和风险评价研究.发表论文10篇.

2015-03-05

国家“863”计划（2013AA06A308）

* 责任作者， 研究员， sll@nies.org