核糖体蛋白L37在前列腺癌中的表达及临床意义

盛镔，张蒙，马鹏德，杨阔，徐勇，王玉琢

（天津医科大学第二医院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

核糖体蛋白L37在前列腺癌中的表达及临床意义

盛镔，张蒙，马鹏德，杨阔，徐勇，王玉琢

（天津医科大学第二医院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

目的：研究人核糖体蛋白L37（RPL37）在前列腺癌中的表达及其临床意义。方法：应用real-time qPCR（RT-qPCR）和Western blot检测64例前列腺癌组织及癌旁组织中RPL37 mRNA和蛋白的表达情况，分析其与前列腺癌患者临床病理特征及生存状况之间的关系。结果：RT-qPCR和Western blot结果表明，前列腺癌组织中RPL37 mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁组织（P＜0.05）；RPL37 mRNA的表达增高与患者血清中的前列腺特异性抗原（PSA）水平增加、高Gleason评分及肿瘤的临床分期有关（P＜0.05），与患者的年龄、淋巴结转移、精囊侵犯及手术切缘无关（P＞0.05）。生存分析表明，前列腺癌患者中RPL37 mRNA高表达组的总生存期显著低于低表达组（P=0.006）。结论：RPL37 mRNA的表达增高与前列腺癌的发生、发展相关；RPL37可以初步判断前列腺癌患者的预后。

RPL37；前列腺癌；RT-qPCR；预后

前列腺癌是欧美国家中老年男性最常见的恶性肿瘤之一［1］。近年来，我国前列腺癌发病率也在不断增加［2］，严重威胁男性健康。探讨前列腺癌的发病机制，将为前列腺癌的临床治疗提供新的思路。核糖体蛋白L37（RPL37）是核糖体蛋白大亚基的组成成分之一，位于5p13，编码97个氨基酸，相对分子质量为11 070，含有多个丝/苏氨酸磷酸化位点和一个锌指结构区域［3］。消减杂交技术研究发现，RPL37在结肠癌组织和前列腺癌组织中表达增高，这提示RPL37可能参与癌症的发生发展［4-5］。因此，本研究就RPL37在前列腺癌组织中的表达进一步分析，并探讨其与临床特征、预后之间的关系。

1 材料与方法

1.1 病例与标本收集天津医科大学第二医院泌尿外科2010年6月-2012年8月手术切除的64例前列腺癌组织，以及距离肿瘤边缘2 cm以上的癌旁正常前列腺组织，组织标本由我院病理科经HE染色明确诊断。患者年龄43～75岁，中位年龄62岁，其中＜62岁者26例，≥62岁者38例；外周血PSA＜10 ng/mL者25例，≥10 ng/mL者39例；Gleason评分＜7者25例，等于7者19例，＞7者20例；临床分期T1者35例，T2和T3者29例；淋巴结转移阴性者40例，阳性者24例；精囊侵袭阴性者43例，阳性者21例；手术切缘阴性者33例，阳性者31例。所有患者术前均未行放、化疗以及内分泌治疗，标本术后立即取材，并放于-80℃保存，供RT-qPCR 和Western blot检测。

1.2 试剂Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）购自Thermo公司，RT-qPCR试剂盒（Fast Start SYBR Green Master）购自Roche公司，引物由苏州金唯智公司合成。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝公司，所需抗体均购自Affinity Bioscience公司，ECL发光液购自Advansta公司。

1.3 实验方法

1.3.1 总RNA提取及逆转录将组织标本用Trizol法提取总RNA，以紫外分光光度仪检测RNA的浓度和纯度，各组吸光度A260/A280均接近2.0，RNA经甲醛变形凝胶电泳证实为完整。采用Thermo公司Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒，在20 μL反应体系中将RNA逆转录成cDNA，产物置于-20℃保存。

1.3.2 RT-qPCR实时定量PCR反应在7900HT Fast Real-Time PCR System上操作，采用Roche公司Fast Start SYBR Green Master试剂，引物序列见表1，反应条件为：94℃3 min，然后94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min共40个循环，最后72℃延伸5 min。基因的相对表达水平通过相对定量法（2-△△Ct）进行分析。每次实验重复3次。

表1 引物序列及扩增长度Tab 1Primer sequence and amplicon size

1.3.3 Western blot提取前列腺癌组织和正常癌旁组织总蛋白应用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，按照每孔50 μg上样量进行SDS-PAGE电泳，冰浴电转至硝酸纤维素膜上，5％的脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗孵育4℃过夜（RPL37 1∶1 000，GAPDH 1∶3 000），室温下二抗孵育1 h（羊抗兔1∶5 000），TBST洗膜3次，ECL发光系统曝光检测。

1.4 统计学处理不同组间的RPL37 mRNA表达水平采用t检验分析，结果通过±s显示；RPL37 mRNA表达和临床指标通过秩和检验分析；生存分析用Kalpan-Meier曲线估计，Log-rank检验。所有分析均借助SPSS20.0统计软件，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 RPL37 mRNA和蛋白在前列腺癌中的表达 RT-qPCR和Western blot检测表明，前列腺癌组织中RPL37 mRNA和蛋白的表达明显高于癌旁组织（图1，P=0.037）。

图1 RPL37 mRNA和蛋白在前列腺癌组织和正常癌旁组织中的表达Fig 1The expression of RPL37 mRNA and protein in prostate cancer tissues and noncancerous tissues

2.2 RPL37 mRNA表达与前列腺癌患者临床指标的关系根据RPL37 mRNA的中位表达水平，将前列腺癌患者分为两组，其表达水平高于中位水平为高表达组（34例），低于中位水平为低表达组（30例）。临床指标分析显示，RPL37 mRNA的高表达与前列腺癌患者术前前列腺特异性抗原（PSA）水平升高、Gleason评分及临床分期增加有关，与其他临床病理特征如年龄、淋巴结转移、精囊侵袭及手术切缘无相关性（表2）。

表2 前列腺癌组织中RPL37 mRNA表达水平与临床指标的关系（n）Tab 2Relation between RPL37 expression and clinical characteristics in prostate cancer tissues（n）

2.3 RPL37 mRNA表达与前列腺癌患者生存时间的关系RPL37 mRNA高表达患者中术后5年内死亡47.1％（16例），生存5年以上者52.9％（18例）；低表达患者中术后5年内死亡20.0％（6例），生存5年以上者80.0％（24例），各组间比较具有显著性差异（P=0.006Logrank检验）（图2）。

图2 前列腺癌患者中RPL37 mRNA表达与生存时间分析Fig 2Association of RPL37 mRNA expression with cum survival of prostate cancer patients

3 讨论

核糖体蛋白是核糖体的重要组成部分，在细胞内蛋白质的合成中发挥重要作用。近年来，越来越多的证据表明，核糖体蛋白还具有核糖体外功能，参与复制、转录、DNA修复、翻译调控及正常细胞的恶性转化等［6］。很多研究发现，肿瘤组织中的核糖体蛋白表达出现改变［7-11］。Vaarala等［4］用消减杂交技术发现，RPL37在前列腺癌细胞LNCaP中的表达水平是正常前列腺细胞PrEC的3.4倍，通过原位杂交技术进一步证实RPL37在前列腺癌组织中表达增加。因此RPL37在前列腺癌的发生发展中可能发挥重要作用。

很多研究报道了关于核糖体蛋白基因的过表达在肿瘤中的作用机制，但RPL37基因高表达在前列腺癌的作用机制目前还不清楚。通过文献复习发现，核糖体蛋白异常表达可能通过以下机制促进肿瘤的发生发展。首先，Sturgill等证实核糖体S6蛋白激酶（RSK）可以激活丝/苏氨酸磷酸化位点使S6蛋白发生磷酸化，从而促进mRNA的翻译，在调节细胞生长和增殖过程中起重要作用［12］；核糖体蛋白的锌指结构能够与核酸（DNA和RNA）结合，这种结合可能使核糖体蛋白干扰细胞内转录和翻译过程，从而导致细胞恶性转变［13］。而Barnard等［3］研究发现RPL37同时含有多个丝/苏氨酸磷酸化位点和一个锌指结构区域。因此，RPL37也可能通过上述作用机制促进肿瘤的发生。其次，大约50％的人类肿瘤中，p53活性丧失或突变［14］。Loging等［15］研究表明，R248W p53突变的结肠癌细胞和何杰金氏淋巴瘤的细胞系中RPL37 mRNA的表达水平增高，这些结果显示p53发生突变时，核糖体蛋白基因表达增高可能是在人类肿瘤中过表达的一种机制。最后，核糖体蛋白基因过表达时具有抗凋亡作用。研究发现，L7、S11及L35a高表达时均导致了肿瘤细胞凋亡抑制的发生［16-17］。在结肠癌细胞系中发现，核糖体蛋白基因的过表达抑制了肿瘤细胞的凋亡，且RPL37的表达在结肠癌组织中明显增高，因此，RPL37的高表达可能通过抗凋亡作用导致结肠癌的发生。

本研究通过RT-qPCR和Western blot检测RPL37 mRNA和蛋白在前列腺癌组织以及癌旁组织中的表达，结果表明，RPL37 mRNA及蛋白在前列腺癌组织中的表达明显增高，且与其癌旁组织相比，差异具有统计学意义，此结果与前人研究相符。本研究同时对RPL37 mRNA的表达量与前列腺癌临床病理特征进行相关性分析，结果显示随着PSA水平、临床分期和Gleason评分的增加，RPL37 mRNA的表达量随之增加，差异均具有显著性，但是与患者年龄、有无淋巴结转移、精囊侵袭及手术切缘无相关性。随后笔者对RPL37 mRNA的表达情况与患者的5年生存率进行分析发现，高表达RPL37 mRNA的患者的5年生存时间明显比低表达组低，说明RPL37基因的高表达降低了前列腺癌患者术后的生存时间。

总之，RPL37在前列腺癌中高表达，与前列腺癌的临床特征具有一定的相关性，且在前列腺癌患者的预后预测中具有潜在的指导价值。由于病例数有限，可能会影响分析的可靠性，有待于积累更多的病例再行进一步的分析。有关RPL37在前列腺癌发生发展中的作用机制目前还不明确，需要进一步后续实验进行深入研究。

［1］Siegel R，Ma J M，Zou Z H，et al.Cancer statistics，2014［J］.CA Cancer J Clin，2014，64（1）:9

［2］Ito K.Prostate cancer in Asian men［J］.Nat Rev Urol，2014，11（4）: 197

［3］Barnard G F，Staniunas R J，Puder M，et al.Human ribosomal protein L37 has motifs predicting serine/threonine phosphorylation and a zinc-finger domain［J］.Biochim Biophys Acta，1994，1218（3）: 425

［4］Vaarala M H，Porvari K S，Kyllönen A P，et al.Several genes encoding ribosomal proteins are over-expressed in prostate-cancer cell lines:confirmation of L7a and L37 over-expression in prostate-cancer tissue samples［J］.Int J Cancer，1998，78（1）:27

［5］Barnard G F，Staniunas R J，Mori M，et al.Gastric and hepatocellular carcinomas do not overexpress the same ribosomal protein messenger RNAs as colonic carcinoma［J］.Cancer Res，1993，53（17）:4048

［6］Wool I G.Extraribosomal functions of ribosomal proteins［J］.Trends Biochem Sci，1996，21（5）:164

［7］An S J，Chen J K，Liu L L，et al.Over-expressed genes detected by suppression subtractive hybridization in carcinoma derived from transformed 16HBE cells induced by BPDE［J］.Biomed Environ Sci，2005，18（5）:302

［8］Ohl F，Jung M，Xu C，et al.Gene expression studies in prostate cancer tissue:which reference gene should be selected for normalization［J］.J Mol Med（Berl），2005，83（12）:1014

［9］Wang M，Hu Y，Stearns M E.RPS2:a novel therapeutic target in prostate cancer［J］.J ExpClin Cancer Res，2009，28:6

［10］Huang C J，Chien C C，Yang S H，et al.Faecal ribosomal protein L19 is a genetic prognostic factor for survival in colorectal cancer［J］. J Cell Mol Med，2008，12（5B）:1936

［11］Karan D，Kelly D L，Rizzino A，et al.Expression profile of differentially-regulated genes during progression of androgenindependent growth in human prostate cancer cells［J］.Carcinogenesis，2002，23（6）:967

［12］Sturgill T W，Wu J.Recent progress in characterization of protein kinase cascades for phosphorylation of ribosomal protein S6［J］. Biochim Biophys Acta，1991，1092（3）:350

［13］Dresios J，Chan Y L，Wool I G.The role of the zinc finger motif and of the residues at the amino terminus in the function of yeast ribosomal protein YL37a［J］.J Mol Biol，2002，316（3）:475

［14］Kirsch D G，Kastan M B.Tumor-suppressor p53:implications for tumor development and prognosis［J］.J Clin Oncol，1998，16（9）:3158

［15］Loging W T，Reisman D.Elevated expression of ribosomal protein genes L37，RPP-1，and S2 in the presence of mutant p53［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，1999，8（11）:1011

［16］Kasai H，Nadano D，Hidaka E，et al.Differential expression of ribosomal proteins in human normal and neoplastic colorectum［J］.J Histochem Cytochem，2003，51（5）:567

［17］Lopez C D，Martinovsky G，Naumovski L.Inhibition of cell death by ribosomal protein L35a［J］.Cancer Lett，2002，180（2）:195

（2015-03-30收稿）

Expression of ribosomal protein L37 in prostate cancer and its clinical significance

SHENG Bin，ZHANG Meng，MA Peng-de，YANG Kuo，XU Yong，WANG Yu-zhuo
（Department of Urology，The Second Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin Institute of Urology，Tianjin 300211，China）

Objective：To explore the expression of ribosomal protein L37 in prostate cancer and its clinical significance.Methods: Quantitative real-time polymerase chain reaction（RT-qPCR）and Western blot were used to measure and compare the levels of the expression of ribosomal protein L37 mRNA and protein in 64 specimens from prostate cancer tissues and surrounding non-tumor tissues. The relationship between RPL37 mRNA expression and clinicopathological factors were statistically analyzed.Results:RPL37 mRNA and protein expression were expressed at higher levels in prostate cancer tissues compared with non-tumor tissues（P＜0.05）.The enhanced expression of RPL37 mRNA was significantly associated with the increased level of PSA，higher Gleason score and clinical stage，but not correlated with age，lymph nodemetastasis，seminal vesicle invasion and surgical margin status.Survival analysis showed that prostate cancer patients with high expression of RPL37 had shorter survival time than those with low RPL37 expression.Conclusion:The elevated expression of RPL37 may be involved in the development of prostate cancer and related to poor survival of prostate cancer patients.

RPL37；prostate cancer；RT-qPCR；prognosis

R737.25

A

1006-8147（2015）05-0401-03

天津市应用基础及前沿技术研究计划（12JCYBJC31400）

盛镔（1989-），男，硕士在读，研究方向：泌尿外科；通信作者：王玉琢，E-mail：ywang1407@126.com。