Girdin蛋白在脑胶质瘤组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

林宪仁，何佳，巴一，马勇杰

（1.天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津 300060；2.天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所细胞生物学实验室，天津 300060）

Girdin蛋白在脑胶质瘤组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

林宪仁1，何佳1，巴一1，马勇杰2

（1.天津医科大学肿瘤医院，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津 300060；2.天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所细胞生物学实验室，天津 300060）

目的：研究Girdin在人脑胶质瘤组织中表达的特点及其与病理特征和预后的关系。方法:应用SP免疫组化技术测定100例脑胶质瘤组织中Girdin的表达情况，分析Girdin表达与患者临床病理特征的关系，Kaplan-Meier生存曲线分析Girdin表达与预后的关系，用Cox比例风险分析影响生存结果的独立预后因素。结果：Girdin在各病理级别脑胶质瘤中均有表达，Girdin在III～IV级脑胶质瘤表达高于Ⅰ～Ⅱ级脑胶质瘤，差异具有统计学意义。Girdin表达与脑胶质瘤恶性程度、肿瘤大小呈正相关，Girdin高表达组患者的预后比低表达组患者差，Cox比例风险分析提示Girdin、年龄、病理学分级及肿瘤大小是脑胶质瘤患者预后影响因素。结论：Girdin可能在促进恶性脑胶质瘤发生发展中起重要作用。

Girdin蛋白；脑胶质瘤；免疫组化；预后

恶性脑胶质瘤是最常见的原发中枢神经系统恶性肿瘤，恶性程度高、术后易复发、对放疗及化疗药物不敏感、预后差，是神经外科领域的难治性疾病［1］。恶性脑胶质瘤的发生、发展和浸润过程的分子机制尚未完全揭晓，因此明确其分子机制有利于临床治疗和改善患者预后。研究发现，Girdin在多种恶性肿瘤组织中表达上调［2-5］，这提示Girdin与恶性肿瘤的发生有密切关系。Girdin蛋白具有募集并联结、调控细胞内微丝的作用，参与调节细胞生长、迁移以及血管生成及自噬等功能［6］。我们采用免疫组化SP方法观察100例脑胶质瘤中Girdin的表达，探讨Girdin蛋白在脑胶质瘤发生发展中的作用及其与临床病理特征的相关性和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 病例资料选用来自天津医科大学肿瘤医院2004年至2012年脑胶质瘤组织标本60例及天津市环湖医院2011年至2012年间脑胶质瘤组织标本40例，全部病例按世界卫生组织（WHO）2007年神经系统肿瘤分级标准诊断，Ⅰ级12例，Ⅱ级35例，Ⅲ级17例，Ⅳ级36例，其中男63例，女37例。年龄9～79岁，中位年龄52岁。所有患者术前均未接受放疗、化疗。随访选用天津医科大学肿瘤医院脑胶质瘤组织标本60例，自病理确诊日开始，至2013 年9月截止。

1.2 免疫组织化学法采用免疫组化（SP）法染色，每例标本经4 μm厚连续切片，脱蜡入水，3％过氧化氢30 min阻断内源性过氧化物酶，经EDTA高压抗原修复2 min 15 s，2％正常山羊血清封闭30 min，加一抗（稀释浓度为1∶60）后4℃孵育过夜，生物素标记的二抗孵育25 min，链霉素亲和素-过氧化物酶孵育20 min，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，梯度酒精分化，常规脱水，干燥，封片。Girdin抗体购自日本IBL公司。

1.3 免疫组化结果判断标准由两位专业病理科医师盲法阅片，对免疫组化检测结果进行评估。采用双盲法统计实验结果，每张切片随机选取10个高倍视野（×400），计算每个高倍视野中阳性细胞数占肿瘤细胞总数的百分比，最后计算此10个视野阳性细胞的平均百分比。Girdin阳性主要定位于胞浆，根据染色强度评分：无棕色颗粒为0分，黄色为1分，棕色为2分，深棕色为3分。阳性细胞百分比：1％～25％为1分，26％～50％为2分，＞50％为3分。将细胞染色程度计分与阳性百分数计分相乘即为综合评分，积分0分为无表达，1～3分为低表达，4～6分为中表达，7～9分为高表达。生存分析：积分0～3分为低表达组，4～9分为高表达组。

1.4 统计学方法应用SPSS 17.0统计软件分析，Girdin与临床病理参数的关系使用方差分析和Spearman’s Rank等级相关分析。总生存（OS）和无进展生存（PFS）使用Kaplan-Meier分析，使用logrank检验。采用多因素Cox比例风险分析患者的生存预后，并用危险比（HR）和95％可信区间（CI）表示。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Girdin蛋白在不同级别脑胶质瘤组织的表达

Girdin主要表达在胞浆中（图1）。在不同级别的脑胶质瘤组织中Girdin表达的程度不同，Ⅰ级脑胶质瘤Girdin的表达强度最低，阳性细胞数最少（图1A），胞浆着色浅；Ⅱ级脑胶质瘤Girdin表达较Ⅰ级强，胞浆有较深的着色（图1B）；Ⅲ级脑胶质瘤中Girdin表达强度高于Ⅰ级和Ⅱ级，胞浆着色深（图1C）；Ⅳ级脑胶质瘤中Girdin表达强度最高，胞浆深染（图1D）。

图1 Girdin在各级神经胶质瘤组织中的表达（SP，×200）Fig 1Girdin expression demonstrated in glioma tissues（SP，×200）

2.2 100例病例中Girdin蛋白不同级别脑胶质瘤中的表达Ⅰ～Ⅱ级脑胶质瘤中Girdin表达阳性率为51％（24/47），低于Ⅲ～Ⅳ级脑胶质瘤的表达阳性率71.7％（40/53），Girdin在脑胶质瘤各级别中的表达强度差异具有统计学意义（P=0.041），Girdin蛋白的表达与性别无显著的相关性，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.3 随访数据完整的60例Girdin蛋白在不同级别脑胶质瘤中的表达在Ⅰ～Ⅱ级脑胶质瘤中Girdin表达阳性率为39.3％（11/28）低于Ⅲ～Ⅳ级脑胶质瘤的表达阳性率78.1％（25/32），Girdin在脑胶质瘤各级别中的表达强度差异具有统计学意义（P=0.006）。Girdin蛋白的表达在不同年龄组、性别、病理类型、肿瘤定位之间的差异无统计学意义（P＞0.05），而与肿瘤大小的差异具有统计学意义（P=0.024）（表2）。2.460例脑胶质瘤患者Girdin蛋白的表达与生存时间的关系Kaplan-Meier法分析表明，在60例脑胶质瘤患者中，Girdin低表达组的患者中位总生存时间为60个月，明显长于Girdin高表达组患者的平均总生存时间（20个月），差异具有统计学意义（P=0.040，图2）。Girdin低表达组和高表达组的中位无进展生存时间分别为48个月和26个月，Girdin低表达组的患者无进展生存明显长于高表达组，差异具有统计学意义（P=0.038，图3）。在多因素分析中，Girdin、病理学分级、肿瘤大小、年龄为影响患者总生存和无进展生存的独立预后因素（表3）。

表1 100例脑胶质瘤病例中Girdin表达和病理参数的关系（n）Tab 1Girdin expression and pathological parameters in 100 cases of glioma patients（n）

表2 随访60例脑胶质瘤病例中Girdin表达和病理参数的关系（n）Tab 2Complete follow up of 60 glioma cases to show the relationship between pathological parametersand and Girdin expression （n）

表3 胶质瘤患者Cox多因素生存分析Tab 3Multivariate analyses for glioma patient survival

图2 Girdin低表达组与高表达组的总生存曲线Fig 2OS curve of low Girdin expression group and high Girdin expression group

图3 Girdin低表达组与高表达组的无进展生存曲线Fig 3PFS curve of low Girdin expression group and high Girdin expression group

3 讨论

Girdin是一种大分子肌动蛋白结合蛋白，该蛋白具有调节肿瘤细胞的生长与凋亡［7-10］，促进肿瘤细胞侵袭与转移以及促进肿瘤血管生成的作用［8-11］。近年来有研究发现，Girdin在许多人类恶性肿瘤细胞中呈现高表达，包含乳腺癌、结直肠癌［11-14］、消化道癌［15］等，在肿瘤的进展与转移中起着十分重要的作用，并且与有些肿瘤细胞的分化程度及生存预后密切相关。Garcia-Marcos等［12］通过研究Girdin在多种肿瘤中的表达及作用机制，发现Girdin特异性高表达主要在侵袭性强的肿瘤细胞中，促进肿瘤细胞的远处转移能力，以此证明Girdin与肿瘤转移有相关性。Girdin的表达也与结直肠癌病患的生存预后相关。有研究说明Girdin可调节肌动蛋白细胞骨架的重组，从而促使脑胶质瘤细胞侵袭与迁移［16］，提示Girdin在脑胶质瘤的发展过程中起着重要作用。此外，Girdin在调控恶性脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的过程中也具有重要的作用。Natsume等［17］通过基因敲除实验研究发现，Girdin在脑胶质母细胞瘤表达缺失时干细胞分化能力增强，且细胞运动、侵袭与转移等能力受到抑制，说明肿瘤干细胞侵袭与转移能力需Girdin的维持，提示Girdin在促使脑胶质瘤的侵袭、转移、发生与发展中具有重要意义。

我们通过免疫组化SP方法观察Girdin在各级别脑胶质瘤中均有表达。本研究结果显示，在脑胶质瘤中Girdin的表达强度从I级到Ⅳ级总体呈现升高的趋势，即随着脑胶质瘤的恶性程度级别增高而表达强度逐渐增强，在恶性程度最高的Ⅳ级脑胶质瘤中Girdin表达显著高于其他级别，提示Girdin在脑胶质瘤的恶性发展中起关键作用，Girdin可能作为反映恶性脑胶质瘤程度的一个重要分子标志物。恶性脑胶质瘤的侵袭性生长是导致其预后差的首要因素，本研究结果表明，Girdin低表达组的脑胶质瘤患者生存期显著长于高表达组的患者。Cox比例风险模型分析提示Girdin、病理学分级、年龄及肿瘤大小是脑胶质瘤患者预后影响因素。Girdin表达强度越强、年龄越大、病理级别越高及肿瘤越大患者预后越差，进一步验证了前期的研究结论。

综上所述，Girdin蛋白主要表达在脑胶质瘤胞浆中，Girdin的表达与脑胶质瘤病理级别及大小相关，且影响患者预后；多因素生存分析表明Girdin、病理学分级、年龄及肿瘤大小为脑胶质瘤患者判断预后的指标，提示Girdin在促进脑胶质瘤侵袭、转移等分子生物学过程中起到了一定的作用。

［1］Zhao S，Tsuchida T，Kawakami K，et al.Effect of As2O3on cell cycle progression and cyclins D1 and B1 expression in two glioblastoma cell lines differing in p53 status［J］.Int J Oncol，2002，21（1）:49

［2］Jiang P，Enomoto A，Jijiwa M，et al.An actin-binding protein Girdin regulates the motility of breast Cancer cells［J］.Cancer Res，2008，68 （5）:1310

［3］Jun B Y，Kim S W，Jung C K，et al.Expression of girdin in human colorectal Cancer and its association with tumor progression［J］.Dis Colon Rectum，2013，56（1）:51

［4］Xu Y，Fu L，Gu F，et al.Expression and significance of phosphorylated Girdin in breast Cancer［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2012，34（3）:205

［5］Enomoto A，Murakami H，Asai N，et al.Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE［J］.Dev Cell，2005，9 （3）:389

［6］Dunkel Y，Ong A，Notani D，et al.STAT3 protein up-regulates Gαinteracting vesicle-associated protein（GIV）/Girdin expression，and GIV enhances STAT3 activation in a positive feedback loop during wound healing and tumor invasion/metastasis［J］.J Biol Chem，2012，287（50）:41667

［7］Woodgett J R.Recent advances in the protein kinase B signaling path［J］.Curr Opin Cell Biol，2005，17（2）:150

［8］Vivanco I，Sawyers C L.The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer［J］.Nat Rev Cancer，2002，2（7）:489

［9］Yamazaki D，Kurisu S，Takenawa T.Regulation of cancer cell motility through actin reorganization［J］.Cancer Sci，2005，96（7）:379

［10］Kitamura T，Asai N，Enomoto A，et al.Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin［J］.Nat Cell Biol，2008，10（3）:329

［11］Liu C，Zhang Y，Xu H，et al.Girdin protein:a new potential distant metastasis predictor of breast cancer［J］.Med Oncol，2012，29（3）: 1554

［12］Garcia-Marcos M，Jung B H，Ear J，et al.Expression of GIV/girdin，a metastasis-related protein，predicts patient survival in colon cancer［J］.FASEB J，2011，25（2）:590

［13］Ghosh P，Garcia-Marcos M，Bornheimer S J，et al.Activation of galphai3 triggers cell migration via regulation of GIV［J］.J Cell Biol，2008，182（2）:381

［14］Ling Y，Jiang P，Cui S P，et al.Clinical implications for girdin protein expression in breast cancer［J］.Cancer Invest，2011，29（6）: 405

［15］陈秀华，林洁，李璐蓉，等.消化系统肿瘤中Girdin基因的表达分析［J］.医学信息:下旬刊，2013，26（12）:97

［16］Zhang B，Gu F，She C，et al.Reduction of Akt2 inhibits migration and invasion of glioma cells［J］.Int J Cancer，2009，125（3）:585

［17］Natsume A，Kato T，Kinjo S，et al.Girdin maintains the stemness of glioblastoma stem cells［J］.Oncogene，2012，31（22）:2715

（2015－01－07收稿）

Expression of Girdin in glioma tissues and its relationship with pathological clinical characteristics and prognosis of the patients

LIN Hsien-jen1，HE Jia1，BA Yi1，MA Yong-jie2
（1.Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，National Clinical Research Center for Cancer，Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China；2.Laboratory of Cancer Cell Biology，Cancer Institute and Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300060，China）

Objective：To investigate the characteristics of Girdin expression and its expression in glioma patients with malignancy grade in the prognosis of these patients.Methods:Girdin expression was investigated using the SP method in glioma tissues in 100 specimens. Kaplan-Meier survival was constructed to assess Girdin expression and living status.Cox Proportional hazard analysis was used to analyze the factors affecting survival prognosis.Results:Protein expression level and pathological grade of glioma were both increased accordingly，patients with high and low protein expressions had a significantly different survival times，where patients with low Girdin expression had higher survival times as compared to patients with high Girdin expression.Cox Proportional Hazard analysis found that Girdin expression，age，pathology grade，and size of glioma were all factors affecting the prognosis of glioma patients.Conclusion:Expression of the protein Girdin is positively correlated with pathological grade of gliomas，and patients with high Girdin expression have poorer prognosis，suggesting that Girdin may play a role in tumorgenesis and progression of gliomas.

protein Girdin；glioma；immunohistochemistry；prognosis

R739.4

A

1006-8147（2015）05-0397-04

林宪仁（1986－），男，硕士在读，研究方向：神经肿瘤中胶质瘤的基础与临床研究；通信作者:马勇杰，E-mail:yongjiemagu@ aliyun.com。