钙网织蛋白促进新生血管形成在类风湿关节炎发病机制中的作用

赵海勇，丁红梅，刘建华，邢冬红，刘弘毅，魏蔚，郑芳△

钙网织蛋白促进新生血管形成在类风湿关节炎发病机制中的作用

赵海勇1，丁红梅2，刘建华3，邢冬红4，刘弘毅4，魏蔚5，郑芳4△

目的探讨钙网织蛋白（CRT）促进新生血管形成在类风湿关节炎（RA）发病机制中的作用。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测活动期RA患者、骨性关节炎（OA）患者和健康对照组（HC）血清以及RA和OA患者关节滑膜液中CRT的含量。采用免疫组织化学（IHC）法检测CRT在RA和OA患者关节滑膜组织中的表达。应用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）体外模型，分别采用MTT实验、细胞划痕实验及构建体外血管生成的三维模型检测CRT在HUVECs增殖、迁移及管腔形成中的作用。结果RA组血清中CRT含量［（6.4±3.1）µg/L］明显高于OA组［（3.7±0.9）µg/L］及HC组［（3.4±1.0）µg/L］；RA组滑膜液中CRT含量［（6.9±3.4）µg/L］明显高于OA组［（3.9±0.7）µg/L］，差异有统计学意义（P＜0.01）。CRT在RA滑膜组织中高表达，主要位于滑膜衬里层和衬里下层的血管内皮细胞及血管周围、炎性细胞内外等，而OA滑膜组织中CRT仅见极少量的表达。MTT实验、细胞划痕实验及体外血管生成三维模型检测结果显示，CRT具有明显促进HUVECs增殖、迁移及管腔形成的作用。结论CRT在RA患者血清、滑膜液及滑膜组织中表达均升高，CRT可能通过促进新生血管形成参与RA滑膜炎和血管翳形成的发病机制。

关节炎，类风湿；新生血管形成；钙网织蛋白

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种常见的全身性自身免疫性疾病，患病率约占世界人口总数的0.5%～1%［1］。RA的主要病理表现为持续的滑膜炎和血管翳形成，继而导致关节软骨、骨及周围组织的破坏，关节间隙变窄，最终导致不同程度的残疾，严重影响患者生活质量，给社会及家庭带来沉重负担。RA的病因和发病机制目前尚未完全明确。近年来有研究表明，钙网织蛋白（calreticulin，CRT）可能参与了RA的发病机制。CRT是内质网中的Ca2+结合蛋白，普遍存在于高等生物的细胞中。CRT还在细胞膜表面及细胞外环境中表达，并发挥重要的免疫调节作用［2］。目前关于CRT在RA发病机制中作用的研究报道较少。本研究通过分析CRT在RA患者体内的表达及在新生血管形成机制中的作用，进一步探讨CRT在RA诊断和治疗中的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012年12月—2014年6月来自天津医科大学总医院感染免疫科和唐山市第二医院关节外科中心的患者，其中血清标本包括活动期的RA患者106例，骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者75例，选取同期收集的来自天津医科大学总医院的80例性别、年龄匹配的健康体检者作为健康对照组（HC），各组基本资料见表1。关节滑膜液和滑膜组织标本取自行关节置换术的25例RA患者和22例OA患者。所有RA患者的临床诊断均符合1987年美国风湿病学会（ACR）修订的诊断标准，所有OA患者的临床诊断均符合1995年ACR的诊断标准。本研究通过了天津医科大学伦理委员会的审查批准，并取得了受试者的知情同意。

Tab.1Clinical characteristics of the patients in each group表1 入组患者与健康对照组的临床基本资料

1.2 方法

1.2.1 采集标本采集受试对象的空腹肘正中静脉血2 mL，3 000 r/min离心10 min，分离血清后保存于-80℃待用。关节滑膜液和滑膜组织标本为患者行关节置换手术时获取，采集滑液3～5 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清保存于-80℃待用。关节滑膜组织取约2 cm×2 cm，10%甲醛溶液固定，室温保存。

1.2.2 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的分离培养采集15～20 cm长的新生儿脐带标本，采用胶原酶脐带灌注消化法分离HUVECs并进行体外培养。选用5代以内的细胞进行实验。

1.2.3 ELISA法检测血清和滑膜液中CRT的含量血清和滑膜液中CRT的含量采用双抗体夹心96孔ELISA试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）检测，严格按照说明书进行操作。

1.2.4 免疫组织化学（IHC）方法检测关节滑膜组织中CRT的表达制作RA和OA患者滑膜组织病理切片，行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和免疫组织化学染色，显微镜下观察CRT在局部关节滑膜组织中的表达。

1.2.5 MTT实验检测CRT对HUVECs增殖的作用将HUVECs（100 μL）按2×103个/孔接种到96孔板，每组设5个复孔，待细胞生长至50%～60%融合时，更换含不同质量浓度CRT（0、1、5、10、50 μg/L）的低血清（1%FBS）DMEM培养基继续培养48～72 h。每孔避光加入MTT溶液（20 μL，5 g/L），混匀后继续孵育4 h，弃去培养基，每孔加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），振荡使结晶物溶解，最后用酶标仪检测波长490 nm各孔的吸光度（A）值。

1.2.6 细胞划痕实验检测CRT对HUVECs迁移的作用预先用marker笔在6孔细胞培养板的背面均匀地划线。收集对数期细胞，以2×105/mL接种，每孔加入2 mL细胞悬液，置于5%CO2、37℃孵箱中培养。待细胞均匀长满孔底后，用无菌枪头垂直于培养板背面的水平线划痕，每孔均匀划3条，弃去培养基，然后用PBS洗3次，加入含CRT（10µg/L）的低血清（1%FBS）DMEM培养基继续培养24～36 h。含血管内皮生长因子（VEGF，40µg/L）的低血清（1%FBS）DMEM培养基为阳性对照，每组设5个复孔，倒置显微镜下观察细胞迁移情况。应用Image J软件计算划痕区域愈合面积，愈合率=（初始划痕面积-现划痕面积）/初始划痕面积×100%。

1.2.7 体外血管生成三维模型的构建取对数生长期的HUVECs，调整细胞悬液密度为2×105/mL，置于冰上备用。将200 μL鼠尾Ⅰ型胶原液（5 g/L）加到12 μL 0.1 mol/L NaOH中，立即混匀。再加入23 μL 10×DMEM溶液，混匀。然后加入760 μL细胞悬液及CRT标准液20 μL，充分混匀后加至细胞培养板中，VEGF（40µg/L）为阳性对照，每组设3个复孔。将培养板在室温下放置20 min，待胶凝固后，加入完全高糖的DMEM培养液，转移到5%CO2、37℃孵箱中培养。24 h后在倒置显微镜下观察管腔形成情况并拍照。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多组间计量资料比较采用one-way ANOVA，多重比较采用SNK-q检验。计数资料组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRT在血清和滑液中的含量RA患者血清中CRT含量显著高于OA组及HC组，而OA与HC组间CRT水平差异无统计学意义（P＞0.05）。RA患者关节滑膜液中CRT含量明显高于OA患者（P＜0.01）。RA患者血清与关节滑膜液中CRT含量差异无统计学意义（t=0.712，P＞0.05），见表2。

2.2 CRT在滑膜组织中的表达HE染色结果显示，RA滑膜组织中呈现典型的滑膜炎性病理学特征，滑膜细胞增生、肥大，大量炎性细胞浸润，新生血管形成等。而OA患者滑膜组织中仅见少量炎性细胞浸润。免疫组织化学染色结果显示，CRT在RA滑膜组织中大量表达，主要位于滑膜衬里层和衬里下层的血管内皮细胞及其周围，炎性细胞内外等。OA滑膜组织中，CRT仅见极少量的表达。见图1。

Tab.2Comparison of serum and synovial fluid CRT levels between groups表2 CRT在各组血清及滑膜液中的含量比较（μg/L，）

Tab.2Comparison of serum and synovial fluid CRT levels between groups表2 CRT在各组血清及滑膜液中的含量比较（μg/L，）

＊＊P＜0.01；a与HC组比较，b与OA组比较，P＜0.01

组别HC OA RA F或t血清n 80 75 106 CRT 3.4±1.0 3.7±0.9 6.4±3.1ab58.043＊＊滑膜液n 22 25 CRT -3.9±0.7 6.9±3.4 4.059＊＊

Fig.1The pathological results of RA and OA synovial tissues图1 RA与OA患者滑膜组织病理学检查结果

2.3 CRT对HUVECs增殖的影响MTT检测结果显示，CRT质量浓度为≤5 μg/L时，对HUVECs增殖的作用较弱，CRT质量浓度升至10 μg/L及以上时，具有明显促进HUVECs增殖的作用（P＜0.05），CRT的作用呈浓度依赖性，见图2。在后续HUVECs迁移及管腔形成的实验中，选用CRT的质量浓度为10 μg/L。

Fig.2Effect of CRT on the proliferation of HUVECs图2 CRT对HUVECs增殖的影响

2.4 CRT对HUVECs迁移的影响细胞划痕实验结果显示，加入10 μg/L CRT组的细胞与对照组相比，细胞发生了明显的迁移，细胞划痕大部分被修复，与阳性对照VEGF组具有相似的促进HUVECs迁移的作用，见图3。

Fig.3Effect of CRT on the migration of HUVECs图3 CRT在HUVECs迁移中的作用

2.5 CRT对体外管腔形成作用的影响CRT（10 μg/L）组可见胶内血管样结构的分支之间相互沟通连接形成复杂的网状结构，与阳性对照VEGF作用相似，而对照组没有形成此种血管结构，见图4。

Fig.4Effect of CRT on the tube formation of HUVECs图4 CRT对HUVECs管腔形成的影响

3 讨论

3.1 新生血管与RA发病RA是最常见的炎性关节病，其病理改变主要表现为滑膜炎和血管翳的形成，而新生血管形成是产生和维持RA血管翳的重要因素。新生血管形成是由内皮细胞、黏附分子及细胞因子参与的协调有序的过程，其形成主要是由滑膜细胞产生的炎性介质激活内皮细胞并使其发生增殖、迁移及管腔形成等过程［3］。新生血管可以维持RA的炎症状态并向病变部位提供营养和氧气以维持疾病的迁延不愈，阻断新生血管进而抑制滑膜炎和血管翳的形成可能成为RA治疗的新靶点［4-5］。

3.2 CRT参与RA炎症反应CRT是内质网中的Ca2+结合蛋白，起着维持细胞内Ca2+稳态和分子伴侣的重要作用。此外，CRT还出现在细胞膜表面及胞外环境中，参与调节多种细胞的黏附、迁移以及细胞凋亡和抗肿瘤免疫应答等过程［6-9］。近年来研究显示，CRT以及炎性标志物血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）等在RA患者体液中表达升高，可用来评估RA疾病的活动程度［10-13］。Ling等［14］研究发现，细胞膜表面的CRT可作为RA共享表位（shared epitope，SE）的信号转导受体介导NO促氧化信号通路，且瓜氨酸化的CRT能增强SE信号［15］。此外，CRT还可通过与凋亡蛋白FasL结合，在T淋巴细胞凋亡中发挥重要作用［10］。

3.3 CRT在RA患者体内的表达本课题组首先检测了CRT在RA患者体内的整体表达。结果显示，RA患者血清、滑膜液及滑膜组织中CRT的表达均显著增高。滑膜液和滑膜组织均取自局部病变部位，它们的变化更能准确地反映疾病的状态。本研究结果提示CRT可能参与了RA发病的病理过程，即关节滑膜炎和血管翳的形成。笔者预期会在局部病变的滑膜液中检测到更高浓度的CRT，但检测结果显示滑膜液与血清中CRT水平差异无统计学意义。原因之一可能是纳入本研究的样本例数偏少，本研究中滑膜液标本取自关节置换术的RA患者，标本采集比较困难。另一方面，尽管滑膜液标本取自新入院RA患者，术前的治疗也可能影响到实验结果。

3.4 CRT在RA新生血管形成中的作用新生血管形成是一个多步骤的复杂过程，内皮细胞的增殖、迁移及芽生形成管腔是新生血管形成的关键步骤。本研究进一步探讨CRT对HUVECs增殖、迁移及管腔形成的影响。结果显示，CRT具有促进HUVECs增殖的作用，CRT作用呈浓度依赖性。且CRT还具有直接刺激HUVECs迁移和管腔形成的作用，与VEGF作用相似。此外，本研究体外实验中所用CRT浓度为10 μg/L，与在RA患者体内检测到的CRT浓度相接近，提示CRT在RA患者体内可能发挥同样的作用。

综上所述，CRT在RA患者体内表达升高，可能通过促进新生血管形成参与了RA滑膜炎和血管翳形成的病理过程，其在RA发病机制中的作用还需进一步深入研究。

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（2015-04-16收稿2015-04-28修回）

（本文编辑李鹏）

Increased expression of calreticulin promotes angiogenesis involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis

ZHAO Haiyong1，DING Hongmei2，LIU Jianhua3，XING Donghong4，LIU Hongyi4，WEI wei5，ZHENG Fang4△
1 Department of Orthopedics，Tangshan Worker′s Hospital，Tangshan 063000，China；2 Department of Clinical Laboratory，The Second Hospital of Tangshan；3 Department of Hand Surgery，The Second Hospital of Tangshan；4 School of Laboratory Medicine，Tianjin Medical University；5 Department of Rheumatology，General Hospital of Tianjin Medical University△

ObjectiveCalreticulin（CRT）is a multifunctional protein of endoplasmic reticulum implicated in the pathogenesis of rheumatoid arthritis（RA）.The present study was undertaken to determine whether CRT was involved in an⁃giogenesis events in RA.MethodsSerum CRT levels were measured by enzyme-linked immnuosorbent assay（ELISA）in 106 patients with established RA，75 osteoarthritis（OA）and 80 healthy controls（HC）.CRT levels in synovial fluid were al⁃so measured in 25 RA and 22 OA patients.The expression of CRT in synovial tissue was examined by immunohistology.In order to investigate the role of CRT on angiogenesis，human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）were isolated and cultured for in vitro experiments.The proliferation，migration and tube formation of HUVECs following CRT stimulation were examined in vitro by MTT assay，scratch wound healing assay and tube formation assay.ResultsOur results showed a sig⁃nificantly higher concentration of CRT in serum［（6.4±3.1）µg/L］of RA patients compared to that of OA［（3.7±0.9）µg/L，P＜0.01］and HC［（3.4±1.0）µg/L，P＜0.01］；and significantly higher CRT in synovial fluid［（6.9±3.4）µg/L］of RA vs OA［（3.9± 0.7）µg/L，P＜0.01］.Increased CRT expression predominantly localized to vascular endothelial cells，inflammatory cells and perivascular areas in both the lining and sublining layers of RA synovial tissue.Furthermore，CRT significantly promoted the proliferation，migration and tube formation of HUVECs，as showed by MTT assay，scratch wound healing assay and tube for⁃mation assay.ConclusionThese findings suggested that CRT may be involved in synovitis and pannus formation events via promoting angiogenesis in RA.

arthritis，rheumatoid；angiogenesis；calreticulin

R593.22

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.08.017

教育部博士点基金资助项目（20101202110008）；天津市应用基础与前沿技术研究计划面上项目（14JCYBJC25600）

1河北省唐山市工人医院骨外一科（邮编063000）；2河北省唐山市第二医院检验科，3手三科；4天津医科大学医学检验学院；5天津医科大学总医院风湿免疫科

△通讯作者E-mail：fangzheng@tmu.edu.cn