正交试验优选欢天安神饮的水提工艺

郭华 李文 赵颖 朱维娜

（南京市中医院，江苏南京 210001）

正交试验优选欢天安神饮的水提工艺

郭华 李文 赵颖 朱维娜

（南京市中医院，江苏南京 210001）

目的：研究欢天安神饮中部分药物的水提工艺，优选提取工艺条件。方法：采用L9（34）正交试验设计，以饮片中（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷和丹酚酸B的提取率为考察指标，以浸泡时间、加水量、提取次数、提取时间等为考察因素，采用HPLC法测定，所得的结果进行方差分析，综合两个指标结果确定最佳工艺。结果：此复方中合欢皮、丹参等药物确定的最佳水提工艺条件为：加饮片总量25倍量的水分3次提取，每次1.5h。结论：优选的工艺稳定，方法可行。

欢天安神饮 提取工艺 正交试验

1 仪器与试药

1.1 仪器1290型安捷伦超高效液相色谱仪；紫外检测器；电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产；KQ-500型医用超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司生产；水浴锅，上海跃进医疗器械厂生产；RV10旋转蒸发器（IKA）。

1.2 试药（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品（中国药品生物制品检定所），供含量测定用，批号：111911-201101；丹酚酸B对照品（中国药品生物制品检定所），供含量测定用，批号：111562-201212；甲醇、乙腈为色谱纯；其余所用试剂均为分析纯，均购自上海化学试剂有限公司；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计采用L9（34）正交表进行正交设计，对浸泡时间、加水量、提取次数、提取时间进行考察，以（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷及丹酚酸B的含量为考察指标，进行水提工艺最佳参数的确定［1］。提取工艺因素水平设计见表1。称取4剂处方量的合欢皮、丹参等9味药材共9份，按相应的因素水平进行水煎，水煎液浓缩成约250mL，备用。

表1 提取工艺因素水平设计

2.2 供试品溶液的制备取约相当于0.5g合欢皮药材的浓缩液5mL，精密量取，置锥形瓶中，精密加入甲醇10mL、水5mL，使溶液甲醇浓度为50%，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 HPLC测定（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷含量

2.3.1 色谱条件色谱柱：Diamonsil C18（2）5u柱（250mm× 4.6mm，225-1125）；流动相为甲醇：水梯度洗脱，0～30min（18∶82），35～40min（100∶0），45～50min（18∶82）；检测波长：204nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。

2.3.2 对照品溶液制备及线性关系考察精密称取于五氧化二磷减压干燥器中干燥24h的（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成1mg/mL的溶液，作为对照品储备溶液。精密吸取1mg/mL（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品溶液0.125、0.25、0.75、1.25、1.75、2.5mL分别置于25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，使浓度分别为0.005、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1mg/mL。分别吸取上述各对照品溶液20μL，进样，按上述色谱条件测定峰面积值，以峰面积均值（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=59.12.83X+ 9.68，r=0.9989。结果表明（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷进样量在0.1～2μg范围内呈良好的线性。

2.3.3 样品中（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量测定分别精密吸取对照品溶液（浓度为0.01、0.05mg/mL）及各供试品溶液20μL注入液相色谱仪，每个样品平行进样2次，以外标两点法计算，测定各样品中（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。结果见表2、表3。

2.4 HPLC法测定丹酚酸B含量

2.4.1 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈：2%乙酸溶液梯度洗脱，0～5min（17∶83）；19～26min（27∶73）；流速：1.0mL/min；检测波长：284nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论板数按丹酚酸B峰计算不低于2000。

表2 正交试验结果

表3 （-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷方差分析

2.4.2 对照品溶液及线性关系考察精密称取经五氧化二磷减压干燥器中干燥24h的丹酚酸B对照品适量，加甲醇制成每1mg/mL的溶液，作为对照品储备溶液。精密吸取1mg/mL的丹酚酸B储备液0.1、0.5、1、2、3、5mL，用50%甲醇定容至10mL的容量瓶中，摇匀，分别得到浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5mg/mL的丹酚酸B系列对照品溶液。分别吸取上述各对照品溶液10μL，进样，按上述色谱条件测定峰面积值，以峰面积均值（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程Y= 11784.73X－58.80，r=0.9999（n=6）。结果表明丹酚酸B进样量在0.1～5μg范围内呈良好的线性。

2.4.3 样品中丹酚酸B的含量测定分别精密吸取对照品溶液（浓度为0.1mg/mL，0.5mg/mL）及各供试品溶液10μL注入液相色谱仪，每个样品平行进样2次，以外标两点法计算，测定各样品中丹酚酸B的含量。结果见表2、表4。

表4 丹酚酸B方差分析

综合（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、丹酚酸B含量的方差分析结果，同时结合生产实际中降低成本、节约时间等因素，最终确定最优工艺条件为A1B2C3D2。即加饮片总量25倍量水分3次提取，每次1.5h。

2.5 最佳工艺验证取4剂处方量的合欢皮、丹参等9味药材各3份，按最佳水提工艺进行提取，即药材不浸泡，加饮片总量25倍量的水，分3次煎煮，每次1.5h。合并水煎液，浓缩至250mL，取样测定水煎液中（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷及丹酚酸B的含量，色谱条件和供试品溶液的制备方法与水提正交样品相同。结果见表5。结果可见，3次试验所测得的（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷及丹酚酸B的含量与最佳工艺所测得的平均含量比较相近，说明该工艺稳定、可行。

3 讨论

实验过程中，饮片的品种繁多，质量差异很大，而且有的饮片中含有的有效成分很低，不能达到制剂的要求，因此在投料前必须控制饮片的质量。

（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量测定参照2010版《中国药典》一部合欢皮项下（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量测定方法。实验曾比较了文献中合欢皮的含量测定方法，流动相为甲醇∶水（34∶66）［2］，但峰形不好，干扰多，故最终确定2010版《中国药典》一部合欢皮项下含量测定方法。因该方药味多，60多分钟仍有峰出现，故最终确定的流动相为梯度洗脱。

丹酚酸B的含量测定参照2010版《中国药典》一部丹参项下丹酚酸B的含量测定方法。实验曾比较了文献中丹参的含量测定方法，流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59），流动相复杂，因本试验所用高效液相色谱仪为二元泵，需要人工将流动相进行混合，增加了误差，经查阅了大量的文献和反复摸索，故最终确定丹参的流动相为上述梯度洗脱方法。

本实验采用正交试验法优选欢天安神饮水提工艺，以（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷和丹酚酸B含量为指标，采用HPLC法进行含量测定，结果进行方差分析，最终优选出A2B2C3D2的制备工艺，又通过最佳水提工艺验证实验也证明了该工艺的合理性。

［1］张建玲，贺祝英，吴红梅.正交试验优选心衰宁合剂水提工艺.中国实验方剂学杂志，2011，17（7）：30

［2］干国平，朱红，师磊，等.不同产地山合欢皮中（-）-丁香树脂酚-4-O-B-D-葡萄糖苷含量的比较.药物分析杂志，2009，29（4）：606

编辑：吴宁

表5 水提工艺验证结果

R289.5

A

1672-397X（2015）11-0056-03欢天安神饮为临床上使用多年的安全、有效方，主要由合欢皮、景天三七、丹参、酸枣仁等9味中药组成，具有解郁安神、活血消肿的功效。因方中君药为合欢皮，其有效成分为水溶性成分，且临床应用剂型为汤剂，故本实验选用水提工艺进行研究，以浸泡时间、加水量、提取次数、提取时间等工艺条件为考察因素，以（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、丹酚酸B的含量为考察指标，进行提取工艺的优化研究。

郭华（1976—），女，本科学历，主管中药师，中药学专业。

李文，本科学历，主任中药师。510531043@qq.com

2015-05-26