桂枝芍药知母汤对CIA大鼠关节炎的作用及其机制研究
2015-11-12胡雨峰俞晶华奚飞飞
胡雨峰 俞晶华 奚飞飞
（南京中医药大学，江苏南京 210023）
桂枝芍药知母汤对CIA大鼠关节炎的作用及其机制研究
胡雨峰 俞晶华 奚飞飞
（南京中医药大学，江苏南京 210023）
目的：研究桂枝芍药知母汤对CIA模型大鼠关节炎症反应的治疗作用及其机制。方法：建立Ⅱ型胶原诱导（CIA）动物模型，随机分为模型组、雷公藤多苷片组和桂枝芍药知母汤高、中、低剂量组，另取10只正常大鼠作为空白对照组，分别给药后观察各组大鼠关节评分和肿胀度、病理改变评分，并比较各组大鼠滑膜上清液中IL-1、IL-6及IL-17的表达。结果：模型组大鼠关节评分、左右足体积、造模足关节肿胀度、踝关节病理改变评分均明显高于空白对照组；治疗16d后，桂枝芍药知母汤各剂量组大鼠上述指标均明显低于模型组（P＜0.01）。模型组大鼠滑膜上清液中IL-1、IL-6及IL-17的表达均明显高于空白对照组（P＜0.01），治疗后桂枝芍药知母汤中、高剂量组大鼠上述指标明显低于模型组（P＜0.01或P＜0.05）。结论：桂枝芍药知母汤可通过调节炎性细胞因子的表达而明显缓解CIA模型动物的各种炎症反应。
桂枝芍药知母汤 类风湿关节炎 关节评分 病理学 SD大鼠 实验研究
桂枝芍药知母汤（下简称桂芍知母汤）出自汉·张仲景《金匮要略·中风历节病脉证并治篇》，具有祛风除湿、温经散寒、滋阴清热之功效，主要用于治疗风寒湿痹日久，渐次化热伤阴之证，至今仍为临床上的常用方、基础方，尤多被用于治疗类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）等以关节病变为主的病症。本研究在建立Ⅱ型胶原诱导（CollagenⅡ-induced arthritis，CIA）动物模型的基础上，观察桂芍知母汤对模型动物关节炎症的治疗作用及其对血清白介素（Interleukin，IL）-1、IL-6及IL-17表达的影响，为其治疗RA的作用及机制进行阐释和解读。
1 实验材料
1.1 实验动物SD大鼠60只，雌雄各半，体重（200g±20）g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，生产许可证：SCXK（沪）2007-0005，实验动物使用许可证：SYXK（苏）2007-0030。
1.2 实验药物桂芍知母汤，药物组成：桂枝12g，白芍9g，甘草6g，麻黄12g，生姜15g，白术15g，知母12g，防风12g，炮附子10g。药物均购自南京中医药大学百草堂中医门诊部，由南京中医药大学药学院制剂室制备成浓度分别为1.2、0.6及0.3g/mL的水煎剂。雷公藤多苷片，10mg/片，由浙江得恩德制药有限公司生产，批号：1108101，研钵研碎后加蒸馏水制成浓度为0.001g/mL的混悬液。
1.3 实验试剂牛Ⅱ型胶原，美国Sigma，批号：A7906；完全弗氏佐剂（Complete Frund＇s Adjuvant，CFA），美国Sigma，批号：F5881；IL-1、IL-6及IL-17 ELISA试剂盒，上海韵涵生物科技公司，批号20111201B；焦碳酸二乙酯（DEPC），美国Sigma。
1.4 实验仪器和设备YLS-7B型大鼠趾体积测量仪，山东省医学科学院设备站；SZ61TRC-ILST型解剖镜，日本Olympus；ROTOFIX 32A型离心机，德国Hettich；-80℃低温冰箱，日本Sanyo；Multiskan MK3型全自动酶标仪，芬兰Labsystems。
2 实验方法
2.1 建立CIA模型将牛Ⅱ型天然胶原溶解于0.1mol/L醋酸溶液中，制成4mg/mL的溶液，并置于4℃冰箱过夜。实验当日将含弗氏完全佐剂与CⅡ胶原等体积于冰上充分震荡乳化制成CⅡ乳剂。用微量注射器于大鼠左后足跖皮内、颈、背、腹、尾根等5个部位分别注射CⅡ乳剂0.1mL，总量0.5mL，并于14d后用同等剂量免疫原在相同部位加强免疫一次。通过定期测定各组大鼠的关节炎指数（ArthriticIndex，AI）及检测大鼠双后足的肿胀度判断模型建立是否成功。
2.2 分组与给药取造模成功的大鼠50只，随机分为5组，每组10只。另取10只正常大鼠作为空白对照组。给药方案：空白对照组与模型组，给予等容量蒸馏水；桂芍知母汤高、中、低剂量组，分别给予桂芍知母汤水煎剂18g生药/（kg·d）（浓度1.2g/mL）、9g生药/（kg·d）（浓度0.6g/mL）以及4.5g生药/（kg·d）（浓度0.3g/mL）；雷公藤多苷片组，给予雷公藤多苷片混悬液0.015g/（kg·d）。以上各组均予灌胃给药，给药体积均为15mL/（kg·d）。第二次加强免疫后即日开始给药，连续给药16d。
2.3 关节评分、双足体积测量及肿胀度计算关节评分采用0—4级关节评分法［1］。0分：脚爪正常或无炎症；1分：趾关节肿胀或轻度发红；2分：趾关节和足跖发红并且肿胀；3分：踝关节以下的整个脚爪全部发红并且肿胀；4分：踝关节严重发红且肿胀，关节有变形迹象。以第二次加强免疫当天为d0，此后每隔4d用大鼠趾体积测量仪测量大鼠左右足跖体积，检测并记录关节炎指数积分，以2个脚爪的评分之和作为每个大鼠的关节评分，并按公示计算出其关节肿胀度。
肿胀度ER（%）=（Vt-V0）/ V0×100%（V0为造模前体积，Vt为检测时体积）
2.4 样本提取及处理连续给药16d后使用脱颈法处死大鼠。将大鼠仰卧位固定，70%酒精消毒，大腿外旋，从内侧切开并剥离皮肤，沿膝关节正中线纵向切开直至暴露出以膝关节为中心的约3cm×3cm大小的区域，用齿镊提起髌骨。沿髌骨上沿约0.3cm×0.4cm处向下切割直至股骨，再沿髌骨向下分离至胫骨，此时即可打开膝关节腔，由髌骨下极向上延续的一层平滑光亮且呈淡黄色的软组织即为滑膜。在解剖镜下以眼科剪小心分离滑膜，将部分组织分组加入适量生理盐水捣碎，3000r/min离心10min后取上清液冻于-80℃低温冰箱保存备用。
2.5 病理组织学检查及评分处死大鼠后，将大鼠的踝关节用10%福尔马林固定，经过脱钙、脱水、常规石蜡包埋、切片（厚度约4～5μm）和常规HE染色后，由病理专业人员检查阅片。具体观察指征包括关节炎症表现、关节滑膜病变、关节骨质破坏等，主要检查指标包含了炎细胞浸润、血管充血、滑膜肿胀、组织坏死等病理变化，最终根据病变轻重程度进行评分，按正常和轻、中、重度异常分别计0～3分。
2.6 滑膜上清液IL-1、IL-6及IL-17含量检测采用酶联免疫吸附法（ELISA），按照试剂盒使用说明测定组织匀浆上清液中IL-1、IL-6及IL-17之含量。
3 实验结果
3.1 各组大鼠治疗各时期关节炎评分比较见表1。
3.2 各组大鼠治疗各时期左右足关节体积比较见表2。
3.3 各组大鼠左足（造模足）治疗各时期关节肿胀度比较见表3。
表1 各组大鼠治疗各时期关节评分（±s）分
表1 各组大鼠治疗各时期关节评分（±s）分
注：与同期空白对照组比较，▲▲P＜0.01；与同期模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表2 各组大鼠治疗各时期左、右足体积比较（±s）mL
表2 各组大鼠治疗各时期左、右足体积比较（±s）mL
注：与同期空白对照组比较，▲P＜0.01，▲▲P＜0.01；与同期模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
3.4 各组大鼠治疗后踝关节病理评分比较见表4
3.5 各组大鼠治疗后滑膜组织上清液IL-1、IL-6及IL-17表达比较见表5。
4 讨论
RA是一种以关节和关节周围组织的非感染性炎症为主的异质性、系统性、慢性自身免疫性疾病。现代中医学者一般将RA归属于“痹证”范畴，但因其病情顽固，迁延难愈，且疼痛遍历周身多个关节的特点，又有别于一般的痹证，是痹证中的特殊类型，尤其与《金匮要略·中风历节病脉证并治篇》中提及的“历节”相似，所谓：“病历节，不可屈伸”，“诸肢节疼痛，身体尫羸，脚肿如脱”。而桂芍知母汤正是医圣张仲景为风湿历节所设，全方仅用药物九味，却配伍精妙，药少效宏，具有寒温并用、温散而不伤阴、养阴而不碍阳等特点，是当代医家用以治疗RA的常用方、基础方。
RA的主要表现包括双手、腕和足关节的对称性多关节炎，亦可累及膝、髋等关节，并可伴发诸多关节外表现。在其关节表现中，肿胀和变形是较为典型的症状。本研究所采用的CIA模型所引发的炎症反应为多发性外周关节炎（以双足，踝、膝关节为主），关节局部可红肿和畸形，病理变化为增生性滑膜炎，关节软骨破坏以及骨侵蚀，血管翳形成和炎性细胞浸润，其临床表现、实验室指标与免疫及病理学改变方面均接近人类RA，故在CIA大鼠模型的基础上通过药物干预并定期观察大鼠关节评分变化，双足体积、肿胀度趋势及膝关节病理改变可了解药物对于关节炎症的治疗作用。
炎性细胞因子的异常表达在RA的炎症反应中起到了重要的作用，被认为是RA炎症及关节损伤的重要介质［2］。这其中，IL-1、IL-6及IL-17的表达与RA的发病均有密切关联。Arend［3］发现，无论是在动物模型还是患者体内，IL-1受体都是重要的抗炎因子，在动物模型中发现，IL-1受体缺乏使得症状得以加重。有实验证明，滑膜液中的IL-6含量可反映局部前炎症变化，尤其是破坏性的病变［4］。Veldhoen等［5］报道，IL-6和转化生长因子-β（TGF-β）发挥协同作用时，可诱导Th17细胞合成并分泌IL-17，而IL-17又能刺激滑膜成纤维细胞分泌IL-6，造成炎症的进展。而Chabaud等［6］发现，IL-17能通过滑膜细胞使得基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的表达水平升高5倍，而在抗IL-17抗体作用下，MMP-1的表达水平降低50%，显示了IL-17在RA损伤中的作用。IL-17致炎的主要途径为促进T细胞激活并刺激上皮细胞、成纤维细胞产生大量炎性细胞因子如IL-6、动脉粥样硬化和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）等而引起炎症［7］。
表3 各组大鼠治疗各时期左足（造模足）关节肿胀度比较（±s）
表3 各组大鼠治疗各时期左足（造模足）关节肿胀度比较（±s）
注：与同期模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
d16组别关节肿胀度（%）动物数（只）d0d4d8d12给药剂量（g·kg-1·d-1）10-桂芍知母汤高剂量组44.2±19.9*41.7±20.7**35.9±16.5**21.7±12.5**48.9±21.4模型组69.2±32.870.1±32.579.4±32.689.6±29.795.8±34.9 1018桂芍知母汤中剂量组10953.2±19.243.2±17.0*35.9±14.5**28.1±11.4**20.7±08.5**桂芍知母汤低剂量组104.557.5±16.953.4±13.046.8±14.9*36.0±14.4**22.6±11.5**雷公藤多苷片组100.01561.5±18.052.9±16.947.2±17.1*42.4±16.3**27.0±13.1**
表4 给药后各组大鼠踝关节病理改变评分统计表（±s）
表4 给药后各组大鼠踝关节病理改变评分统计表（±s）
注：与模型组比较，**P＜0.01。
组别动物数（只）给药剂量（g·kg-1·d-1）空白对照组病理评分10--模型组10-13.5±1.581桂芍知母汤高剂量组10181.3±2.767**桂芍知母汤中剂量组1093.2±2.820**桂芍知母汤低剂量组104.55.3±3.164**雷公藤多苷片组100.0150.8±1.687**
表5 各组大鼠治疗后滑膜组织上清液IL-1、IL-6、IL-17含量比较（±s）pg/mL
表5 各组大鼠治疗后滑膜组织上清液IL-1、IL-6、IL-17含量比较（±s）pg/mL
注：与空白对照组比较，▲▲P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
组别动物数（只）空白对照组给药剂量（g·kg-1·d-1）10 IL-1IL-6 -IL-17 37.772±15.75586.978±18.2956.353±2.505模型组-88.447±49.774▲▲119.224±24.585▲▲20.902±9.134▲▲10桂芍知母汤高剂量组101848.498±7.433*90.755±21.542*10.093±6.172**桂芍知母汤中剂量组10950.523±10.053*85.882±22.451**10.066±6.184**桂芍知母汤低剂量组104.569.184±33.720103.954±23.50116.112±9.984雷公藤多苷片组100.01539.633±6.766*76.257±2.974**11.785±7.342*
本研究我们发现，自d0起，模型组的关节评分、左右足体积及肿胀度一直保持上升趋势，而桂芍知母汤各剂量组相关指标则持续下降，直至d16；同时在病理评分方面，桂芍知母汤各剂量组均远低于模型组，显示桂芍知母汤可缓解模型动物关节肿胀、变形等症状并改善关节病理变化，对模型动物的关节炎症有较为明显的治疗效果；而桂芍知母汤高、中剂量可明显减少模型动物滑膜上清液中IL-1、IL-6及IL-17的含量，提示桂芍知母汤可通过调节IL-1、IL-6及IL-17的表达而起到缓解关节炎症反应的作用。
［1］张均田.现代药理学实验方法.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998：1383
［2］Klimiuk PA，Yang H，Goronzy JJ，et al.Production of cytokines and metalloproteinases in rheumatoid synovitis is T cell dependent.Clin Immunol，1999，163：491
［3］ArendW.Cytokineimbalanceinhepathogenesisof rheumatoidarthritis：theroleofinterleukin1receptor antagonist.Arthritis Rhrum，2001，30：1
［4］CarterSD，Barnes A，Gilmore WH.Canine rheumatoid arthritis and inflammatory cytokines.Vet Immunol Immunopathol，1999，69（2-4）：201
［5］Veldhoen M，Hocking RJ，Atkins CJ，et al.TGF-β in the context of an inflammatory cytokine milieu supports the enovodifferentiationofIL-17-productingTcells. Immunity，2006，24（2）：179
［6］Chabaud M，Garnero P，Dayer JM，et al.Contribution of interleukin17tosynoviummatrixdestructionin rheumatoid arthritis.Cytokine，2000，12（7）：1092
［7］Komiyama Y，Nakae S，Matauki T，et al.IL-17 plays an importantroleinthedevelopmentofexperimental autoimmune encephalomyelitis.Immunol，2006，177（1）：566
p
R684.305
A
1672-397X（2015）11-0076-04
胡雨峰（1985—），男，博士，讲师，中医内科学专业，风湿免疫病研究方向。
奚飞飞，博士，助理研究员。xifeifei@163.com
2015-08-27
编辑：吴宁
南京中医药大学自然科学基金资助项目（13xzr10）；南京中医药大学哲学社会科学基金资助项目（13xsk29）；南京中医药大学中医痹病学重点学科开放课题基金项目（BBXK2013104）
