偏最小二乘法（PLS）建模分析麻黄细辛附子汤对肾阳虚外感小鼠的干预作用

侯衍豹 杨勇，2 容蓉 孙启慧 蒋海强 李荣荣

（1.山东中医药大学，山东济南 250355；2.山东省经方研究重点实验室，山东济南 250355）

偏最小二乘法（PLS）建模分析麻黄细辛附子汤对肾阳虚外感小鼠的干预作用

侯衍豹1杨勇1，2容蓉1孙启慧1蒋海强1李荣荣1

（1.山东中医药大学，山东济南 250355；2.山东省经方研究重点实验室，山东济南 250355）

目的：采用偏最小二乘法（PLS）整体判断麻黄细辛附子汤对肾阳虚小鼠外感模型的干预作用。方法：KM雄性小鼠91只随机分空白对照组、模型组、利巴韦林组、连花清瘟组和麻黄细辛附子汤（MXF）低、中、高、剂量组。除空白对照组外其余各组小鼠采用腹腔注射苯甲酸雌二醇（8mg/kg）法复制肾阳虚小鼠模型，采用流感病毒FM1尿囊液（血凝滴度为1：320）滴鼻感染小鼠，建立肾阳虚小鼠外感模型。感染1d后各组分别给药，每日1次，共6d。观察各组小鼠的体重、肛温变化。采用SIMCA-P软件处理小鼠的体重、肛温、各脏器指数、死亡率等指标，应用偏最小二乘法通过整体评价，综合判断造模情况及不同药物的干预效果。结果：PLS分析处理表明，与空白对照组比较，模型组综合药效分值显著较低（P＜0.01）；各给药组综合药效分值与模型组比较都有显著性差异（P＜0.01），各给药组都表现出了一定的治疗效果，其中麻黄细辛附子汤中剂量效果更佳。结论：采用PLS分析方法对肾阳虚外感模型及各组药物干预进行综合评价，能较好地反映证候及中药复方整体调控作用的特点，避免某一个或几个指标评价容易引起片面结论的弊端。

麻黄细辛附子汤 流行性感冒 肾阳虚 数学建模 综合药效评价 脏器指数 KM小白鼠 实验研究

流行性感冒是由流感病毒引起的上呼吸道病毒感染性疾病，发病率高，潜伏期短，易暴发流行，是人类最常见的上呼吸道感染性疾病之一［1］。我国传统治疗感冒的中成药对流感引起的症状疗效好，且能标本兼治，毒副作用相对较小。流感的高发病人群多属于中医学肾阳虚者［2］，对于此类人群服用单纯治疗流感的药物是否见效及效果如何尚不明确，偏最小二乘法（PLS）目前是一种较先进的多元分析方法，主要用于解决化学样本分析中存在的变量多重相关，以及解释变量多于样本点等实际问题，能够解决许多普通多元回归方法无法解决的问题，其应用不断扩展，涉及化学、机械、生物、医学、药物学等领域［3］。本实验选用目前在季节性流感治疗中主流的中成药之一连花清瘟胶囊，和西药利巴韦林作为阳性对照药，以《伤寒论》中所记载的治疗少阴病兼表证（及肾阳虚外感）的经方麻黄细辛附子汤作为受试药，来比较它们对肾阳虚外感的治疗效果差异，并采用SIMCA-P软件的偏最小二乘法（PLS）回归进行数据统计建模分析，避免选用某一个或几个指标评价易引起片面结论的弊端，目的是通过PLS分析方法对药理模型及药物干预进行综合评价为中医临床上辨证选方、辨病用药提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物KM小白鼠，雄性，体重（20±2）g，SPF级，由山东鲁抗动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK（鲁）20080002。

1.2 试剂与药物苯甲酸雌二醇，宁波第二激素厂，批号140627；流感病毒甲型（FluA，北京地方株引自中国CDC病毒病研究所）；利巴韦林颗粒，四川百利药业有限责任公司，批号131210；麻黄、炮附子、细辛，济南市建联中药有限公司中药饮片厂，经山东中医药大学李峰教授鉴定符合《中国药典》2010年版标准；连花清瘟胶囊（石家庄以岭药业股份有限公司，批号130144）。

1.3 仪器智能恒温控制仪（成都泰盟科技有限公司），DT-880B型手持式人体表面温度快速筛检仪（深圳市华盛昌机械实业有限公司），ZIL-2型小鼠自主活动仪（北京医科院药研所），01193-YP601N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组小鼠按体重和肛温随机分成肾阳虚外感组（模型组）、利巴韦林组、连花清瘟组、麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组，并设空白对照组。

2.2 造模与给药

2.2.1 肾阳虚模型参考文献［4］的方法并改进造模剂量，20mL/kg腹腔注射0.4mg/mL苯甲酸雌二醇稀释液，每日1次，连续15d，复制肾阳虚模型。空白对照组小鼠腹腔注射生理盐水20mL/kg。于造模12～13d进行相关指标检测，通过测定自主活动、肛温、趾温、游泳时间［2］，以判定模型成功与否。

2.2.2 肾阳虚外感模型将复制成功的肾阳虚模型小鼠用流感病毒FM1鸡胚尿囊液（血凝滴度为1∶320）50μL/只滴鼻感染，空白对照组小鼠滴鼻接种等量生理盐水。

2.2.3 给药第0日为接种病毒前，第1日接种流感病毒，2～7d为药物干预治疗。小鼠灌胃量为10mL/kg，利巴韦林组予0.0625g/kg利巴韦林，麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组分别予2.5、12.5、25g/kg麻黄细辛附子汤，连花清瘟组予0.525g/kg莲花清瘟胶囊，空白对照组、模型组灌服蒸馏水，每日1次，连续给药6d。

2.3 观察指标每日测量接种流感病毒后小鼠的体温、体重1次，记录变化趋势，并观察过程中小鼠的临床症状如精神状况、活动度、饮食等变化，并记录过程中每组动物的死亡数目。实验结束取各组小鼠肺、脾、胸腺等组织，称取脏器重量，计算脏器指数。

2.4 统计学方法单因素方差分析：实验数据用SPSS17.0软件统计分析，计量数据均以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。偏最小二乘法分析：采用SIMCA-P软件的偏最小二乘法（PLS）对各组综合药效学进行评价分析。

3 实验结果

3.1 各组小鼠体重变化空白对照组小鼠体重明显增长；从接种流感病毒起，肾阳虚外感模型组小鼠体重呈持续降低趋势直到第7日未见恢复，造模第2日起体重与空白对照组小鼠比较，有显著性差异（P＜0.01）；利巴韦林组小鼠体重虽开始呈降低的趋势，但之后逐渐恢复，药物干预第3日起已明显高于模型组（P＜0.05）；麻黄细辛附子汤不同剂量组小鼠体重呈明显上升趋势，自干预第3日起明显高于模型组（P＜0.05），干预第4日起与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

3.2 各组小鼠肛温变化从接种病毒到第5日空白对照组小鼠肛温明显高于其他组小鼠，差异有统计学意义（P＜0.01）；接种病毒第1～5日模型组小鼠肛温较空白对照组显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，各药物治疗组小鼠肛温于接种病毒第4日起明显升高（P＜0.05），麻黄细辛附子汤各剂量组相对于其他给药组有升高的趋势但无显著性差异（P＞0.05）。见图2。

图1 各组小鼠体重变化比较

图2 各组小鼠肛温变化比较

3.3 各组小鼠死亡率、肺指数比较与模型组比较，各组药物均有不同程度降低小鼠死亡率的作用，而麻黄细辛附子汤中、高剂量能够显著性降低肾阳虚外感小鼠的死亡率。与空白对照组比较，模型组小鼠肺指数明显增大（P＜0.01），与文献报道一致［5-6］；与模型组比较，各给药组小鼠肺指数明显降低（P＜0.05），表明经药物干预后肺感染程度明显改善。见表1。

表1 各组小鼠死亡率、肺指数比较

3.4 采用PLS对各组综合药效学进行评价分析

3.4.1 对本实验7个组原始数据进行标准化处理自变量表见表2。

表2 肾阳虚外感模型指标变量标识表

3.4.2 得分图及VIP变量投影重要性指标综合药效得分图见图3。变量投影重要性指标用来描述自变量对因变量的解释能力，VIP值越大，自变量x对y的解释能力越强。用VIP值大于1的变量建立药物对肾阳虚外感干预作用PLS回归模型。y=0.148X23-0.11X25+0.165X9+0.159X10-0.029X17+ 0.156X11+0.15X12+0.025X27+0.025X28+0.025X29+ 0.025X30-0.015X16-0.016X4。见图4。各组小鼠综合药效分值比较见图5。

图3 各组小鼠综合药效得分图

从结果可以看出，各给药组综合药效分值与模型组比较都有显著性差异（P＜0.01）。与空白对照组相比模型组综合药效分值显著较低（P＜0.01），根据得分图可以看出空白对照组、模型组能显著分开，说明肾阳虚外感模型的制备可行，反映出明显的病理损伤状态。给药组相对于模型组都表现出了一定的治疗效果，根据各给药组综合药效分值比较图可以看出综合药效分值平均数越接近空白对照组、远离模型组综合药效学效果越显著，麻黄细辛附子汤低、中、高剂量都表现出了良好的药效效果，其中麻黄细辛附子汤中剂量尤佳。

图4 阳虚外感模型VIP直方图

图5 各组小鼠综合药效分值比较图（±s）

4 讨论

本研究采用连花清瘟胶囊作为中药对照药，考虑原因有二：其一，治疗外感疾病，连花清瘟胶囊作为复方中药，具有多成分、多靶点的中药作用特点，且研究发现，“对于甲型H1N1流感，连花清瘟在缩短病程和减少病毒载量上与奥司他韦疗效相似，可作为治疗H1N1病毒感染的另一有效药物，连花清瘟胶囊可以显著改善病毒性肺炎小鼠的症状和存活率，可降低细胞因子表达水平，从而改善肺部炎症［7］。其二，连花清瘟胶囊可“用于治疗流行性感冒属热毒袭肺证”，与本研究的肾阳虚外感证还是具有较大的区别，所以运用连花清瘟胶囊和麻黄细辛附子汤分别干预肾阳虚外感小鼠模型，它们的作用差别也从另一个角度反映出“方证相应”的必要性，本研究的综合药效评价也反映出这点。

本研究结果表明，模型组动物由于接种了流感病毒出现了肺部水肿、充血、炎症等症状，导致肺指数相对于空白对照组升高并出现了较高的死亡率，各给药组都有降低肺指数及死亡率的趋势，说明各给药组都有改善肺部炎症提高小鼠存活率的效果。模型组动物为肾阳虚体征，其机体免疫功能下降，脾、胸腺、肾上腺作为体内重要的免疫器官，其脏器指数呈降低趋势。本研究综合中医的证模型（肾阳虚）和西医的致病因素（流感病毒FM1鼻腔滴注感染），建立了病证结合的肾阳虚外感模型，通过整体的外观状况、生理状态、自主活动、被动负重游泳等指标，结合趾温、肛温动态监测，感染病毒后死亡率比较，肺组织病理改变综合评价，较好地模拟了临床肾阳虚外感的病证状态。

动物的动态生理指标虽然比较简单，但能直接和准确地反映机体健康状态，再结合肺指数、死亡率等客观的金指标能快速地判断出模型的状态及药物干预的大体效果；另外，这种整体动态的生理、病理指标评价也较符合中医“证候”的特点（动态的、疾病阶段性的、外观症状为主的描述表征）。但目前有关中医证候、中药复方的药效评价常局限于某个指标或某几个指标的判断，有时会根据实验的设计或部分有显著性差异的结果来判断，容易导致以偏概全或片面的结论。我们采用的PLS统计分析，目的是将相关的药效指标进行标准化处理，然后采用数学建模，综合起来进行比较分析（类似于综合测评模式），可更客观地评价复合病证动物模型及中药复方的整体疗效。

本实验使用SIMCA-P软件中的PLS来处理药理学数据，通过得分图可以看出空白对照组及肾阳虚外感组在二维图上区分很明显，说明肾阳虚外感模型制备较好。VIP图中可以看出死亡率、肛温、肺指数等指标对综合药效结果的影响是最大的，这与药理学分析判断方法一致。各给药组综合药效得分及比较图可以看出麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组相对于其他给药组表现出了更好的治疗效果，其中麻黄细辛附子汤中剂量组治疗效果尤佳。中剂量相当于临床的等效剂量，这也提示麻黄细辛附子汤使用时要注意选择合适的剂量范围。本实验结果表明，使用PLS来分析处理药理学数据简便可靠，能较好地反映证候特征及中药复方的整体调控作用，避免某一个或几个指标评价容易引起片面结论的弊端，为中医临床上辨证选方、辨病用药提供了更客观的实验依据。

［1］李世宏，梁纪兰，杨锐乐，等.中药抗流感病毒研究进展.中兽医医药杂志，2007，26（5）：26

［2］杨勇.肾阳虚外感小鼠模型建立及麻黄细辛附子汤干预研究.济南：山东中医药大学，2012

［3］王惠文，吴载斌.偏最小二乘回归的线性与非线性方法.北京：国防工业出版社，2006：9

［4］陈素红，吕圭源，范景，等.海马不同提取物对雌二醇致肾阳虚小鼠的影响.中草药，2009（2）：258

［5］刘培民，张鸿彩，包培蓉．升降散抗流感病毒实验研究．山东中医药大学学报，2001，25（1）：43

［6］闫怀士，李京培．艾灸抗小鼠流感病毒性肺炎的实验研究.上海针灸杂志，2006，25（7）：43

［7］钟南山.从SARS到H7N9——中医药治疗的启发.第十届国际络病学大会会议报告

R511.605

A

1672-397X（2015）11-0079-04

侯衍豹（1990—），男，硕士研究生，从事中药及复方药理和毒理研究。595044561@qq.com

杨勇，博士，副教授，硕士研究生导师。yy7204@163.com

2015-06-08

编辑：吴宁

国家自然科学基金项目（81273626）；国家科技重大专项（2014ZX09509001-001）；山东省高校中医药抗病毒协同创新中心资助项目（XTCX2014B-02）；山东省中医药科技发展计划（2013-026）；山东省教育厅科技发展计划（J10LF20）