原生质体融合选育耐高温柠檬酸生产菌

徐 凯，张伟国

（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

原生质体融合选育耐高温柠檬酸生产菌

徐 凯，张伟国

（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

为获得耐高温柠檬酸生产菌，利用原生质体融合技术将具有优良性状的高产菌株W和耐高温柠檬酸生产菌Y-711进行融合，筛选耐高温的高产柠檬酸生产菌。通过变色圈筛选得到融合株R502，在40℃培养72 h就可产酸118.7 g/L，其产酸量比亲本菌株分别高10.5%和21.0%，培养时间分别减少14.3%和7.7%，该菌株遗传稳定。原生质体融合是一种有效获得耐高温柠檬酸生产菌的方法。

原生质体融合；黑曲霉；耐高温柠檬酸生产菌株

柠檬酸，又名枸橼酸，是生物体主要的代谢产物之一，被广泛应用于食品、医药和化工等行业中［1］。近年来，柠檬酸的需求量越来越大，因此，选育优良性状的柠檬酸生产菌株备受重视。当前柠檬酸生产用菌株多为不耐高温菌株，发酵生产过程中需要大量冷却水控制发酵温度，从而使生产成本居高不下。据武国庆等［2］测算，300 m3发酵罐的发酵温度每升高1℃，则每吨柠檬酸至少减少循环冷却水量15.2 t。耐高温柠檬酸生产菌生长快、代谢活力高、发酵周期短，有利于提高设备利用率，减少冷却水用量，降低生产成本。但是，目前国内外对柠檬酸生产菌株的研究多集中于利用物理、化学方法提高产量，忽略了对耐高温菌株的研究，所以对其开展研究有一定的实际意义。

原生质体融合是20世纪50年代发展起来的一项重要的基因重组技术［3-4］，灭活原生质体融合技术则是原生质体融合技术的一个重要发展［5］。灭活原生质体融合就是利用适当的方法处理单一亲株或双亲株的原生质体，其某一位置的生理结构产生微小损伤而失去再生能力。经融合后，由于致死损伤部位的互补而形成再生的融合体［6］。因此，利用灭活原生质体融合技术选育耐高温生产菌株具有可行性。

黑曲霉经过多次物理诱变和化学诱变后，产量很难再提高。故笔者通过对黑曲霉原生质体融合条件的研究，希望能够打破长期诱变带来的积累效应，获得耐高温高产菌株，应用于实际生产。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

黑曲霉W和黑曲霉诱变株Y-711均保藏于工业生物技术教育部重点实验室。其中，黑曲霉W为35℃时产量较高、生产周期较长的菌株，但是在40℃时不产酸；诱变株Y-711为诱变得到的耐高温菌株，生产周期较短，但产酸较低。

1.1.2 培养基

固体培养基（PDA）（g/L）：葡萄糖20，马铃薯200，琼脂20。0.1 MPa、121℃下灭菌20min。

选择培养基：PDA固体培养基补加0.04%溴甲酚绿。

菌丝生长培养基：PDA液体培养基补加5 g/L酵母膏，5 g/L蛋白胨。

高渗培养基：PDA固体培养基补加0.6 mol/L NaCl。

发酵培养基：质量分数为25%玉米粉液化液与清液按体积比1∶4混合，（NH4）2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，MnSO4·4H2O 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，K2HPO41 g/L。pH 4.0。0.1 MPa、121℃灭菌20min。

1.1.3 试剂

磷酸缓冲液（PBS）：0.2 mol/L磷酸缓冲液，加入0.4 mol/L NH4Cl；pH 6.0。

渗稳剂：0.8 mol/L NaCl溶液。

酶液：蜗牛酶、溶菌酶和纤维素酶以质量比1∶3∶7的比例用PBS溶液配制，用0.22μm滤膜除菌后于4℃冰箱过夜备用。

1.1.4 主要仪器

光学显微镜，上海沪杏光学仪器有限公司；台式高速离心机，美国贝克曼库尔特公司；单人净化工作台，苏州净化设备有限公司；全温摇床，太仓强乐实验有限责任公司；恒温振荡器，常州国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 总酸的测定

发酵液经定性滤纸过滤后吸取1mL，用0.142 9 mol/L NaOH溶液进行滴定，所消耗的NaOH毫升数即为发酵液中柠檬酸的质量浓度（g/L）［7］。

1.2.2 总糖的测定

发酵液经过定性滤纸过滤，稀释适当倍数，用蒽酮硫酸法［8］测定。

1.2.3 还原糖的测定

发酵液经过定性滤纸过滤，稀释适当倍数，用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法［9］测定。

1.2.4 黑曲霉原生质体的制备

1）菌丝培养 将在PDA斜面上生长旺盛的两亲本菌株孢子，制成孢子悬浮液，将其孢子含量稀释至108个/mL。取0.1mL接种于菌丝生长培养基中，于35℃、200r/min的摇床上培养24 h。

2）原生质体的制备 3 000r/min离心5min，将菌丝与培养基分离，并用渗稳剂洗涤2次，洗涤后置于离心管中。加入配制好的酶液，32℃恒温水浴振荡酶解2.5 h。用4层高级擦镜纸过滤后，3 000r/min离心15min将滤液分离，用渗稳剂洗涤3次后，重悬收集到的原生质体［10］。

1.2.5 黑曲霉原生质体灭活

将收集到的两亲株的原生质体适当稀释，使其密度为105个/mL。在2个直径9 cm的培养皿中分别加入5mL悬浮液。将培养皿置于15 W紫外灯下10 cm处，分别振摇照射1、3、6、9和12min，然后每皿取200μL涂布于高渗平板上，在35℃下培养48 h后进行菌落计数［11］。并按上述步骤重复试验2次。按式（1）计算灭活率，选择灭活率刚好达到100%时为最佳灭活条件。

1.2.6 原生质体融合

将灭活后的双亲原生质体等量混合于无菌离心管中，加入预热的1mL聚乙二醇（PEG）6 000溶液，混匀后于35℃恒温水浴摇床上振荡10min，然后用渗稳剂洗涤离心。稀释适当倍数后涂布多个高渗平板，在35℃下培养3～5 d，进行菌落计数，按式（2）计算融合率。

式中：A表示融合后涂布的高渗平板，B表示灭活前双亲等量混合后接种的高渗平板。

1.2.7 融合株的筛选

将融合后的菌株点种到选择培养基上，40℃下培养3～5 d，挑选变色圈较大的菌株进行摇瓶发酵实验，然后从中挑选产酸较高的菌株。

1.2.8 融合株稳定性实验

将产酸较高的菌株进行多次传代培养，并分别测其产酸量，以此来确定其是否具有遗传稳定性。

2 结果与讨论

2.1 黑曲霉双亲株的紫外灭活结果

通过对高渗平板上的菌落计数，按照式（1）计算灭活率，得到黑曲霉双亲株的紫外灭活数据，结果如图1所示。

图1 黑曲霉双亲株紫外灭活结果Fig.1 UV-inactivated results of parent Aspergillus niger strain

由图1可知：黑曲霉双亲株在15 W紫外灯下10 cm处振摇照射6min后，灭活率都刚好到达100%。为了防止照射紫外时间过长引起黑曲霉原生质体严重损伤，因此选择灭活率刚好达到100%为最佳条件。

2.2 PEG质量分数的选择

对原生质体融合有影响的因素有很多，但是PEG的质量分数是其中较为重要的一个。如果PEG浓度太低，渗透压就较低，会导致原生质体破裂，而且也不利于原生质体相互靠近而融合。但是如果PEG浓度过高，又会引起原生质体的皱缩和中毒。因此，考察PEG质量分数对原生质体融合的影响，结果见图2。

图2 PEG质量分数对融合率的影响Fig.2 Effect of PEG mass concentration on fusion rate

由图2可知：当PEG质量分数小于45%时，由于渗透压较低，原生质体融合相对来说较为困难。当PEG质量分数大于45%时，由于溶液浓度过高，对原生质体的损害开始出现，使得融合率开始下降。当PEG质量分数为45%时，原生质体的融合率最高。故选择45%的PEG对原生质体进行融合。

2.3 融合时间的选择

融合时间的长短对于原生质体融合同样非常重要，因此，考察融合时间对融合率以及再生的影响，结果见图3。

图3 融合时间对融合率的影响Fig.3 Effect of fusion time on fusion rate

由图3可知：融合率随着融合时间的延长先增大后减小，当融合时间为10min时，融合率最高。产生此现象的原因是如果融合时间过短，参与融合的原生质体数量不多而且不稳定，然后用渗稳液洗涤，又使得刚开始融合的原生质体被分开，从而导致融合率偏低；如果融合时间过长，PEG对原生质体产生毒害作用，不利于原生质体的再生，从而降低融合率。

2.4 融合温度的选择

考察融合温度对原生质体融合率的影响，结果见图4。

图4 温度对融合率的影响Fig.4 Effect of temperature on fusion rate

由图4可知：随着融合温度的升高，融合率先升高后下降，当融合温度为35℃时，融合率最高。这可能是因为高温可以降低PEG的黏度，增加细胞质膜的流动性，从而有利于融合，使融合率上升。但是如果温度过高，则会对原生质体产生很大的损伤，而不利于原生质体的融合，使融合率下降。

2.5 融合菌株的筛选

融合结束后，经过选择培养基初筛，摇瓶发酵复筛，筛选产酸较高的菌株。多次进行原生质体融合后，总共筛选得到5株产酸较高的菌株，其产酸能力如表1所示。

表1 各菌株的总酸产量Table 1 Total acid production of the strains

2.6 菌株遗传的稳定性

分别对筛选得到的5株菌，传代5次并分别测其产酸量，以此考察菌株的遗传稳定性，结果如图5所示。

图5 菌株遗传稳定性结果Fig.5 Results of genetic stability of fusion strains

由图5可知：菌株R502和R811产酸能力稳定，未发现有退化现象，具有较好的遗传稳定性。其中R502产酸较高，故选为目的菌株。

2.7 融合菌株与亲株的产酸性能和耗糖性能比较

考察融合菌株与亲株的产酸性能和耗糖性能，结果如图6所示。

图6 融合菌株和亲株产酸与耗糖能力的比较Fig.6 Comparison of acid production and sugar comsuptin of fusion strain and parental stains

由图6可知：3株菌在产酸和耗糖方面具有一致性。即在发酵前18 h，产酸和耗糖较少，此时菌体处于分生孢子膨胀和萌发阶段。发酵24 h左右菌体进入对数期，耗糖快速增加，产酸量较少，主要原因是此时糖主要用于菌体生长。之后菌体进入稳定期，产酸量和耗糖都大幅度增加，这一时期是柠檬酸积累的主要时期。在72 h左右，糖的浓度已经较低，菌体生长较缓慢，柠檬酸的积累开始变少，这时发酵基本接近终点。在结束发酵时，三菌株总糖和还原糖含量都基本相同，但是融合菌株R502在总酸产量和耗糖速率上都优于亲株。因此，融合株R502产量较高，生产周期较短。

对于柠檬酸生产菌的选育，较为有名的是上海工业微生物研究所选育的黑曲霉Co-827［12］，该菌株在200 g/L初糖中35℃发酵4 d，产酸可高达180 g/L。而耐高温柠檬酸生产菌较为有名的为金其荣等［13］以黑曲霉H-142为出发菌株，采用γ线、硫酸二乙酯及高温热处理单独或复合诱变，筛选得到的菌株HQL-601，其可在40℃发酵60 h产酸130 g/L。本文中，笔者筛选得到的菌株与以上两菌相比，产酸水平还有一定的差距，但是生产周期比黑曲霉Co-827在35℃时发酵的周期要短，因此也具有一定的实际意义。

3 结论

通过实验确定了黑曲霉双亲株紫外灭活的最佳时间和融合的最优条件，即：紫外照射6min，PEG质量分数为45%，在35℃下融合10min。在此条件下，筛选得到了稳定遗传的融合株R502，在40℃培养72 h就可产酸118.7 g/L，总酸产量和生产速率都优于亲株。在诱变过程中，诱变株Y-711通过各种诱变方法已经很难再大幅提高产量，但是通过此实验，其产量再次大幅提高，从而打破了长期诱变的积累效应，对实际生产有一定的指导、应用价值。

［1］王博彦，金其荣.发酵有机酸生产与应用手册［M］.北京：中国轻工业出版社，2000.

［2］武国庆，罗虎，邓立康，等.中粮生产企业对工业生物技术发展的若干思考［J］.中国基础科学，2009（22）：100-104.

［3］Islam M S，Begum R，Choudhury N.Semi-pilot scale production of citric acid in cane molasses by gamma-ray induced mutant of Aspergillus niger［J］.Enzyme Microb Technol，1986，8（8）：469-471.

［4］Bonatelli R.Studies of citric acid production by Aspergillus niger mutants［J］.Biotechnol Lett，1982，4（11）：761-766.

［5］王娟娟，贾彦军.微生物原生质体融合方法的综述［J］.畜牧科技兽医信息，2005（10）：17-19.

［6］朱平，李焕娄.微生物原生质体灭活及其在育种中的应用［J］.国外医药抗生素分册，1990，11（6）：409-413.

［7］代真真，周勇，刘玉伟，等.柠檬酸发酵过程中液化条件的影响［J］.食品与生物技术学报，2011，30（5）：723-727.

［8］李艳玲，张显忠，苗苗，等.蒽酮-硫酸法测定海藻糖含量显色条件的改进［J］.食品工业科技，2009（2）：296-298.

［9］朱海霞，石瑛，张庆娜，等.3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定马铃薯还原糖含量的测定［J］.中国马铃薯，2005，19（5）：266-269.

［10］武金霞，赵睿，张贺迎.米曲霉种内原生质体融合选育优良菌株［J］.中国酿造，2012，31（2）：132-136.

［11］唐洁，车振明，李明元，等.不同灭活方法在原生质体融合选育米曲霉菌株中应用的研究［J］.中国调味品，2010，35（9）：65-69.

［12］刘林明，王燕，杨平平，等.柠檬酸菌种选育研究进展［J］.中国调味品，2014，39（8）：115-118.

［13］金其荣，兰青道，朱宝镛.柠檬酸发酵高温生产菌株选育［J］.微生物学报，1993（3）：204-210.

（责任编辑 荀志金）

High temperature resistant critic acid producing strain breeding by protoplast fusion

XU Kai，ZHANG Weiguo
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To obtain high temperature resistant critic acid producing strain，the protoplast of high-yield strain W and high temperature resistant mutant strain Y-711 were fused.The obtained fusion strain R502 produced 118.7 g/L acid after cultivation at 40℃ for 72 h.The acid yield of stain R502 increased 10.5%compared with strain W and 21.0%compared with strain Y-711，respectively.Cultivation time reduced 14.3%compared to strain W and 7.7%compared to strain Y-711，respectively.The strain R502 was genetically stable.Protoplast fusion is an effective method to obtain a high temperature resistant citric acid producing strain.

protoplast fusion；Aspergillus niger；high temperature resistant critic acid producing strain

Q784

A

1672-3678（2015）05-0026-05

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.005

2014-10-10

国家自然科学基金（31171640）

徐 凯（1988—），男，山东淄博人，硕士研究生，研究方向：菌种选育及发酵条件优化；张伟国（联系人），教授，E-mail：zhangwg168@ 126.com