冻融产氨棒杆菌细胞转化法制备三磷酸腺苷

丰文飞，欧志敏，沈绍传，贠军贤

（1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032；2.浙江工业大学 化工学院 绿色化学合成技术国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310032）

冻融产氨棒杆菌细胞转化法制备三磷酸腺苷

丰文飞1，欧志敏1，沈绍传2，贠军贤2

（1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310032；2.浙江工业大学 化工学院 绿色化学合成技术国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310032）

微生物发酵和酶转化法是工业上制备三磷酸腺苷（ATP）的有效途径。以腺嘌呤为关键底物，用冻融通透化处理的产氨棒杆菌细胞转化制备ATP，用高效液相色谱（HPLC）法检测ATP含量，考察各种转化条件对ATP产率的影响，确定最优转化条件：菌体用量40 g/L，底物6 g/L，葡萄糖60 g/L，MgSO415 mmol/L，KH2PO4120 mmol/L，反应液pH 7.4，反应温度35℃。在最优转化条件下，ATP产率达到85.00%，比优化前提高了58%，细胞用量大幅度降低，优化条件稳定可行。

产氨棒杆菌；三磷酸腺苷；生物转化；腺嘌呤

三磷酸腺苷（ATP）是生物体内能量交换的中心物质，在临床上被广泛用于肌肉萎缩、心肌梗塞、肝炎等疾病和各种急救病症的治疗［1-3］，还具有抗疲劳的功效，有助于运动员增加能量［4］。此外，ATP在环保［5］及卫生监测［6］等领域也有广泛应用。ATP的国内外需求量大，对其进行生物体外合成的研究具有重要意义。

ATP的传统制备方法有动物肌肉提取法［7］、光合磷酸法［8］、酶催化合成法［9-10］及一磷酸腺苷（AMP）化学合成法［11］等，但成本或环境污染等问题限制了其在工业领域的广泛应用。近几年，工业化制备主要集中于微生物转化法或酶转化法，如以腺苷或AMP等为主要底物，用啤酒酵母、面包酵母、产氨棒杆菌和霉菌等微生物可以合成ATP［12-13］。

张国睿等［14］以腺嘌呤为底物，用固定化酵母转化合成ATP，细胞用量400 g/L。Tanaka等［15］将产氨短杆菌ATCC6872接入培养基，在培养的第3天投入腺嘌呤，在上清液中分别生成了1.37 mg/mL的ATP和一定量的二磷酸腺苷（ADP）、AMP。朱家荣等［16］用固定化酵母转化腺嘌呤合成 ATP。Kadowakib等［17］用细菌和面包酵母混合发酵，65%的腺嘌呤转化为ATP。程金芬等［18］用短杆菌B1-787和酵母混合发酵腺嘌呤生产ATP。Fujio等［19-20］和Maruyama等［21］曾用产氨短杆菌KY13510转化腺嘌呤，细胞用量100～120 g/L，又通过添加聚氧乙烯硬脂胺（POESA）和二甲苯起始酶促反应，以Na2HPO4作磷酸基团供体，用发酵法制备ATP，产率为82%。Zhu等［22］用霉菌以腺嘌呤为底物合成ATP。但是，发酵法生产ATP反应时间过久，需定时定量投加各种反应物，为增加细胞通透性还需添加表面活性剂，大量菌体发酵会消耗过多培养原料，增加投入成本，同时发酵产物复杂，增加产物的分离难度，整个发酵过程不可控因素较多，对设备要求较高。转化法相对来说简单易行，产物也比较单一，便于后续分离。

笔者以腺嘌呤为底物，不使用表面活性剂，用冻融通透化处理的产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes）转化法制备ATP，采用高效液相色谱（HPLC）法监测产物生成动态。用单因素试验考察初始细胞用量、底物浓度、葡萄糖浓度、MgSO4浓度、KH2PO4浓度、反应液pH和反应温度等多种因素对ATP产量的影响，并设计正交试验优化转化条件，以提高ATP产率和底物转化率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

C.ammoniagenes CICC10168购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基

固体培养基［21］（g/L）：蛋白胨10，NaCl 5，牛肉膏5，琼脂25。pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min。

种子培养基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 2.5，MgSO42，KH2PO41，尿素2.5。pH 7.2～7.4，115℃灭菌20min。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖 80，酵母膏 10，KH2PO415，K2HPO4·3H2O 15，MgSO410，CaCl20.1，尿素4，MnSO40.02。pH 7.2～7.4，115℃灭菌20min。

1.1.3 主要试剂及仪器

腺嘌呤和ATP二钠盐，上海生工生物工程有限公司；色谱纯甲醇，Sigma-Aldrich公司；其余试剂均为市售国产分析纯。

Agilent 1260型高效液相色谱仪（HPLC），美国安捷伦公司；TG16-WS型台式高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；HZ-2011K-A型恒温摇床，太仓市华利达实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 C.ammoniagenes CICC10168生长曲线

冻干管种子F0接种固体培养基，经斜面活化后作为F1代种子，再经斜面活化作为F2代。从F2代斜面挑取少量菌体，接种于种子培养基中，平行3个样，每小时取样500μL，稀释10倍至5mL，于600nm处测定吸光值（OD600），绘制菌体生长曲线［23］。

1.2.2 菌种的扩大培养

将处于对数生长期的菌体作为种子，以10%的接种量接种于液体发酵培养基中，于30℃摇床160r/min培养48 h，8 000r/min离心10min后，湿菌体-20℃保存备用。

1.2.3 冻融法提高细胞的通透性

离心后的菌体置于-20℃冰箱冷冻4 d，取出后室温下融解，再放置于-20℃冰箱冷冻，稍后取出，室温融解，此过程重复3次。

1.2.4 冻融细胞转化法制备ATP单因素试验

将经过冻融处理后的产氨棒杆菌接种于反应液中，接种量为40 g/L。在文献［24］基础上稍加改进，反应液组成：葡萄糖 80 g/L，KH2PO4240 mmol/L，MgSO420 mmol/L，腺嘌呤6 g/L，KOH调pH 7.0。将10mL转化液置于50mL锥形瓶中放入摇床（32℃，160r/min）反应。取样离心（8 000r/min，5min），稀释后采用HPLC法检测含量。

其他组分不变，分别改变底物和葡萄糖的质量浓度以及KH2PO4和MgSO4的浓度，进行单因素试验。

1.2.5 正交试验设计优化转化条件

在单因素试验的基础上，选取最佳底物浓度、最佳葡萄糖浓度、最佳KH2PO4浓度、最佳MgSO4浓度4个因素为考察对象，采用“四因素三水平”方案进行正交试验，研究影响ATP产率的因素，以期获得最佳的转化条件。

1.2.6 分析方法

采用高效液相色谱法检测ATP含量，色谱柱为C18柱（5μm，4.6 mm×150 mm）。流动相为磷酸盐缓冲液（A）和甲醇（B）（体积比95∶5），磷酸盐缓冲液为35 mmol/L Na2HPO4和15 mmol/L KH2PO4，pH 6.5。检测波长 259nm。流动相的流速为 0.3mL/min、柱温25℃、进样量20μL。

在文献［25］分析条件基础上，用梯度洗脱模式，设置时间程序：0min，V（A）∶V（B）=95∶5；7min，V（A）∶V（B）=95∶5；8min，V（A）∶V（B）=70∶30；20min，V（A）∶V（B）=70∶30；25min，V（A）∶V（B）=95∶5。

1.2.7 ATP收率和底物转化率的计算

分别配制不同浓度的ATP标准液和腺嘌呤标准液，HPLC分析，绘制标准曲线，ATP的回归方程为Y1=91.521X1+47.276，r1=0.999；腺嘌呤回归方程为Y2=359.96X2-2.733，r2=0.999。计算ATP和腺嘌呤浓度，再计算ATP收率和腺嘌呤转化率。

2 结果与讨论

2.1 C.ammoniagenes CICC10168的生长曲线和对数期的确定

实验前，首先对产氨棒杆菌的生长曲线进行测定。根据测定结果，菌体对数生长期为8～20 h。0～8 h是菌体生长的延迟期，20 h后菌种生长达到稳定期。采用对数生长期的菌种进行接种，用于菌种的大规模培养，本文中，采用生长18 h的菌体作为种子用于扩大培养。

2.2 底物浓度的影响

在HPLC条件下，发现两目标物的分离效果良好。选取腺嘌呤质量浓度为3、4、5、6、7和8 g/L分别进行转化试验，基础反应液其他成分不变，反应结果如图1所示。由图1可知：底物质量浓度从3 g/L增加到6 g/L，ATP的生成随之增加，6 g/L时达到峰值，再继续增加底物的量，对产物ATP生成不利，可能过量的底物对产物的生成有抑制作用；从底物腺嘌呤转化率指标分析，虽然低浓度时接近完全转化，但ATP产量和产率不高，因为低浓度时底物反应量不充足。综上考虑，选择底物质量浓度为6 g/L进行进一步研究。

图1 底物浓度对ATP浓度和产率的影响Fig.1 Effects of substrate concentration on ATP concentration and yield

图2 葡萄糖浓度对ATP浓度和产率的影响Fig.2 Effects of glucose concentration on ATP concentration and yield

2.3 葡萄糖浓度的影响

葡萄糖作为产氨棒杆菌生长和产酶的碳源，对底物的转化效率有重要影响。基础反应液其他成分不变，改变葡萄糖质量浓度（20、40、60、80、100和120 g/L）进行转化试验，考察ATP产量和产率的变化，结果如图2所示。由图2可知：葡萄糖质量浓度从20 g/L增至60 g/L，ATP的生成量随之增加，在60 g/L葡萄糖时达到峰值，ATP产量和产率均较高；继续增加葡萄糖的量，对产物生成不利，葡萄糖质量浓度超过60 g/L时，ATP的含量反而降低，其主要原因可能是微生物代谢葡萄糖需消耗ATP。因此，选择葡萄糖质量浓度为60 g/L。

2.4 Mg2+浓度的影响

Mg2+是很多酶的辅酶或辅助因子，是影响酶活的主要离子之一。Luthi等［26］研究发现，Mg2+会螯合等摩尔的ATP，因此，产氨棒杆菌对底物进行转化的过程中保证Mg2+的供给非常重要。考察5～30 mmol/L范围内不同Mg2+浓度对ATP生成的影响，结果如图 3所示。由图 3可知：Mg2+浓度为 20 mmol/L时，产物的产量和产率达到峰值。

图3 Mg2+浓度对ATP浓度和产率的影响Fig.3 Effects of magnesianion concentration on ATP concentration and yield

2.5 KH2PO4浓度的影响

产氨棒杆菌转化腺嘌呤合成ATP是连续的磷酸化过程，因而KH2PO4的浓度是影响转化反应过程中ATP产率的重要因素之一。笔者采用KH2PO4作为磷酸基团的供体，研究40～240 mmol/L范围内KH2PO4浓度对ATP生成的影响，结果如图4所示。由图4可知：随着KH2PO4浓度的增加，产物ATP的量也在不断增加，KH2PO4浓度为120 mmol/L时，ATP的产量达到最佳值，此后磷酸盐浓度继续增加，ATP的产量不会继续提高。因此，KH2PO4的最佳浓度为120 mmol/L。

图4 KH2PO4浓度对ATP浓度和产率的影响Fig.4 Effects of KH2PO4concentration on ATP concentration and yield

2.6 正交试验优化转化条件

在单因素试验的基础上，选取最佳的底物浓度、葡萄糖浓度、KH2PO4浓度及MgSO4浓度这4个因素为考察对象，采用“四因素三水平”方案进行正交试验，以期获得最佳的转化条件。试验设计结果及分析如表1和表2所示。

极差值的大小表明该因素水平的改变对结果的影响大小，极差值越大，该因素对ATP产率的影响越大。由表2可知：各因素对ATP产率的影响从大到小依次为腺嘌呤、葡萄糖、KH2PO4、MgSO4。为了获得最大的产率，应选择的最优组合是腺嘌呤6 g/L、葡萄糖60 g/L、MgSO415 mmol/L和 KH2PO4120 mmol/L，采用此组合进行转化试验，ATP平均产率达到78%，比优化前（基础反应液，ATP产量12.30 g/L，产率54%）提高了46%。

表1 正交试验设计与结果Table 1 Design and results of the orthogonal experiments

表2 正交试验极差分析Table 2 Range analysis of the orthogonal experiment

2.7 初始pH的影响

产氨棒杆菌C.ammoniagenes CICC10168的最适生长pH为7.2～7.4（菌种保藏中心提供），因此，笔者在pH 6.8～7.8范围内取6个梯度来考察pH对产物生成的影响，结果如图5所示。由图5可知：在菌体最适生长pH范围内，产物的生成几乎不受影响；而超出最适生长pH范围，pH都对产物的生成不利，所以菌体最适生长pH也是C.ammoniagenes CICC10168制备ATP最优的pH。因此，确定产ATP的最佳pH为7.4。

2.8 转化温度的影响

C.ammoniagenes CICC10168最高耐热温度为42℃，因此，考察30～42℃范围内不同温度对转化的影响，结果见图6。由图6可知：温度超过40℃后，ATP的产量下降，可能是部分酶活性受到了影响，从而阻碍了产物的生成。由此可见，35℃对产物的生成最为有利。

2.9 最佳接种量的选择

选择冻融菌体量分别为20、30、40、50和60 g/L，其他条件不变，研究接种量对ATP浓度和产率的影响，结果如图7所示。因腺嘌呤溶解度限制，菌体用量20 g/L时反应结束，然而腺嘌呤并未完全溶解，所以转化量不能确定，产物产率无法计算，故图7中没有相应数据。从图7可以看出：菌体用量40 g/L时，已经完成底物的最大转化，继续增加菌体用量对产物生成不利，可能是因为过量的菌体自身代谢消耗了转化液中原料，阻碍了底物的转化，所以选取40 g/L为菌体的最佳用量。

图6 温度对ATP浓度和产率的影响Fig.6 Effects of temperature on ATP concentration and yield

图7 菌体用量对ATP浓度和产率的影响Fig.7 Effects of cell amount on ATP concentration and yield

图8 最优条件下转化反应过程中ATP含量、菌体量和ATP产率的动态变化Fig.8 Variations of ATP concentrations，cell concentrations and ATP yield during the reaction process under the optimal conditions

2.10 最优转化条件下的转化反应

按上述试验得到的最优条件，即腺嘌呤6 g/L、葡萄糖60 g/L、MgSO415 mmol/L、KH2PO4120 mmol/L、pH 7.4和35℃，投加40 g/L冻融菌体进行反应，取样检测ATP含量及菌体量的变化，结果如图8所示。由图8可见：随着反应的进行，产物ATP在逐渐积累，在8 h时左右达到最大积累量（19.5 g/L），ATP产率85%。菌体量随反应进行在缓慢增加，这是因为冻融法处理细胞只是增加了细胞的通透性，并没有破坏细胞结构，细胞亦没有凋亡。底物进入细胞后，利用细胞内呼吸链的酶系统进行一系列酶促反应转化得到ATP。未衰亡的细胞接受底物利用葡萄糖、磷酸盐和Mg2+实现有氧呼吸，产生ATP的过程也出现细胞的生长现象（一般情况下细胞的生长是利用营养要素和呼吸作用提供的能量来实现细胞体积的增加），所以在转化反应的过程中，细胞量呈现出了缓慢的增长趋势。新增长的细胞因通透性差，几乎不参与底物的转化反应。转化起始阶段与转化完成后的反应液的HPLC色谱图如图9所示。由图9可知：转化产物比较单一，为后续的分离提供了很大的便利，满足工业化生产的需求。

图9 反应初始阶段与完成后的HPLC谱图Fig.9 HPLC analysis of ATP and adenine content at the initial and final stages in the reaction

在条件优化后，反应液中ATP质量浓度为19.46 g/L，相对原始对照（12.30 g/L）提高了58%。比较本研究结果与国内外文献报道结果的差异，结果见表3。由表3可知：本研究中，ATP产率达85.00%，腺嘌呤转化率为90%，冻融菌体接种量40 g/L，这些工艺条件在国内外都处于较优水平，为 ATP的工业生产提供良好借鉴。

表3 腺嘌呤转化合成三磷酸腺苷成果比较Table 3 Comparison of transformation achievement for synthesis of ATP from adenine in references

3 结论

本研究不使用表面活性剂，直接用冻融细胞转化腺嘌呤制备ATP，通过单因素试验和正交试验确定了ATP的最优转化条件：菌体接种量40 g/L、底物腺嘌呤6 g/L、葡萄糖60 g/L、MgSO415 mmol/L、KH2PO4120 mmol/L、反应液 pH 7.4和反应温度35℃。最优转化条件下，ATP产率可达85.00%，底物转化率为90%。该优化条件稳定可行，所用菌体量少，菌体处理容易，转化耗时短，过程简单容易控制，实现了原料定量投入与ATP较高产出的目标。这表明C.ammoniagenes在制备ATP方面有优势，可为ATP的工业生产提供良好借鉴。

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（责任编辑 管 珺）

Preparation of ATP by permeable Corynebacterium ammoniagenes cells with frozen-thawed processing

FENG Wenfei1，OU Zhimin1，SHEN Shaochuan2，YUN Junxian2
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2.State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology，College of Chemical Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

In industrial process，ATP can be produced by fermentation with microbial strains or biotransformation with enzymes.In this work，permeable Corynebacterium ammoniagenes cells with frozenthawed processing were used to synthesize ATP using adenine as the primary substrate.The preparation conditions were studied experimentally and ATP concentration in the culture broth was detected by high performance liquid chromatography（HPLC）.The optimum condition was observed，i.e.，wet cells 40 g/L，adenine 6 g/L，glucose 60 g/L，MgSO415 mmol/L，KH2PO4120 mmol/L，pH 7.4 and the reaction temperature at 35℃.As a result，adenine was biotransformed successfully into ATP with the yield about 85.00%，which was 58%higher than that before the optimization.The amount of cells needed in the present process was much less than those without frozen-thawed processing.The optimum conditions obtained were stable and feasible.

Corynebacterium ammoniagenes；adenosine triphosphate；biotransformation；adenine

TQ92

A

1672-3678（2015）05-0001-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.05.001

2014-09-20

国家自然科学基金（21036005）；科技部中欧政府间国际合作专项（1017）；浙江省自然科学基金（LZ14B060001）

丰文飞（1987—），女，安徽桐城人，硕士研究生，研究方向：微生物制药；欧志敏（联系人），教授，E-mail：oozzmm@zjut.edu.cn