硫辛酸对高糖诱导小鼠RIN-m5F细胞保护作用的机制

高翠翠，唐雪，2，蔺忆，陈立立，施用晖，2，乐国伟*，2

（1．江南大学食品学院，江苏无锡214122；2．食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡214122）

硫辛酸对高糖诱导小鼠RIN-m5F细胞保护作用的机制

高翠翠1，唐雪1，2，蔺忆1，陈立立1，施用晖1，2，乐国伟*1，2

（1．江南大学食品学院，江苏无锡214122；2．食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏无锡214122）

探究α-硫辛酸（α-LA）对高糖诱导RIN-m5F细胞的保护机制。RIN-m5F细胞分为对照组（11 mmol/L葡萄糖）、葡萄糖损伤组（22 mmol/L或44 mmol/L葡萄糖）、α-LA干预组（上述3个葡萄糖浓度+200 μmol/L α-LA），分别检测细胞内活性氧自由基（ROS）、丙二醛（MDA）水平、总抗氧化能力（T-AOC）及超氧化物歧化酶（SOD）活性；BAX、BCL-2、GSK-3β mRNA表达水平；细胞线粒体膜电位及蛋白印迹法检测GSK-3β和p-Ser9 GSK-3β蛋白质水平。结果表明，与糖损伤组相比，200 μmmol/L α-LA显著降低胞内ROS水平，分别降低30%和83%；增强细胞SOD活性及T-AOC能力，降低MDA积累；上调抗凋亡因子BCL-2 mRNA表达水平，下调促凋亡蛋白质BAX mRNA表达水平，提高细胞线粒体膜电位。此外，α-LA能够下调GSK-3β mRNA表达水平，提高p-Ser9 GSK-3β蛋白质水平，表明α-LA对高糖诱导RIN-m5F细胞的抗氧化和抗凋亡保护作用与调节GSK-3β有关。

硫辛酸；葡萄糖；氧化应激；细胞凋亡

高血糖导致的胰岛β细胞损伤是糖尿病发生的重要环节，高浓度葡萄糖环境导致细胞内氧化系统与抗氧化系统失衡，从而造成细胞各项功能受损，而胰岛β细胞抗氧化酶（如CAT、GPx、SOD）活性相对较低，更易受到氧化损伤而引发糖尿病［1］。

α-硫辛酸（α-LA）在糖尿病及其并发症的预防及治疗中已经有所应用。α-LA与其还原形式二氢硫辛酸（DALA）均具有较强抗氧化作用，可通过直接清除氧自由基、螯合金属离子如铜和铁、再生内源性抗氧化剂和修复氧化损伤等途径减轻机体氧化应激［2-4］。多项研究已经证实α-LA对细胞的保护作用，例如它可以抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡［5］，抑制TNF-a诱导的肝细胞及骨髓基质细胞凋亡［6-7］；也有研究表明α-LA能够减少自由基对胰岛β细胞的损害，对抗凋亡。但是α-LA保护胰岛β细胞的具体机制尚未明确［8-9］。

GSK-3β在多种信号传导过程中起关键作用，它不仅通过激活糖原合成酶调节细胞糖代谢及能量代谢过程，而且在细胞生长、分化、突变和凋亡等生命活动中也具有重要的调控作用［10］。研究显示，GSK-3β是胰岛细胞增殖分化的限速酶。正常小鼠敲除GSK-3β可提高胰岛β细胞功能，饲喂高脂日粮后仍具有正常的葡萄糖耐受能力及胰岛功能［11］。姜黄素可以通过增加GSK-3β Ser9磷酸化水平抑制GSK-3β活性，对抗Aβ导致的线粒体代谢缺陷和氧化应激［12］。此外，LA可通过增加p-GSK-3β水平保护活性氮介导的心肌细胞损伤［13］，抑制GSK-3β表达，对抗BV-2细胞炎症反应［14］。

目前，α-LA对胰腺β细胞抗氧化保护作用是否与GSK-3β有关，尚未有报道。因此，本研究以胰岛素瘤细胞株（RIN-m5F）为对象，探究α-LA可能的抗氧化机制，以期为I型糖尿病的防治提供有价值的理论依据。

1　材料与方法

1.1试剂和仪器

小鼠胰岛素瘤细胞系RIN-m5F，江南大学药学院金坚教授馈赠。RPMI 1640培养基，胎牛血清，GIBCO公司产品；α-LA（纯度99%），江苏富士莱医药化工有限公司产品；DCFH-DA荧光探针试剂盒，JC-1线粒体膜电位测定试剂盒，碧云天生物公司产品；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒，南京建成生物工程研究所研制；Trizol，荧光染料SBY，美国Biomiga公司产品；M-MLV逆转录酶，Promega公司产品；基因引物，上海捷瑞生物工程有限公司产品；兔抗鼠GSK-3β抗体，p-Tyr216GSK-3β抗体，p-Ser9GSK-3β抗体，美国Cell Sinaling公司产品；其他试剂均为国产分析纯试剂。Spectra Max M5/M5e酶标仪，美国Molecular Devices公司制造；7900HT Fast Real-Time PCR仪，美国ABI公司制造；FACS Calibur流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司制造；Fluor Chem FC3型化学发光成像分析系统，美国Protein Simple公司制造。

1.2细胞培养

RIN-m5F培养于含体积分数10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，在37℃和体积分数5%CO2培养箱中培养，待细胞长至80%～90%融合时，以质量分数0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2体积比传代培养。

1.3实验分组及处理

细胞贴壁长至50%体积时，分别转入不同条件培养基继续培养72 h。实验分组：对照组（11mmol/L葡萄糖）；糖损伤组（22 mmol/L葡萄糖，44 mmol/L葡萄糖）；α-LA干预组（11 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L α-LA，22 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L α-LA，44 mmol/L葡萄糖+200 μmol/L α-LA）。

1.4活性氧自由基（ROS）测定

细胞接种于96孔板，分组及处理同上。去除培养液，加入稀释好的DCFH-DA探针，使其终浓度为10 μmol/L，37℃培养箱内孵育30 min，用无血清培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞的DCFH-DA。M5荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

1.5氧化应激指标的测定

取对数生长期的细胞接种于6孔板，分组及处理同上。预冷磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L PBS）清洗细胞2次，RPMI细胞裂解液于冰上裂解细胞5 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液，-20℃保存待测。

严格按照试剂盒说明书测定细胞裂解液中相关指标：MDA、SOD、T-AOC。

1.6细胞线粒体膜电位测定

取对数生长期的细胞接种于6孔板，分组及处理同上。严格按照JC-1线粒体膜电位试剂盒说明书测定，实验独立重复3次。

1.7Real-Time PCR检测细胞内相关基因mRNA表达水平

Trizol法提取细胞总RNA，取2.0 μg总RNA，经反转录为cDNA（20 μL反应体系），-20℃保存。PCR扩增条件：预变性95℃，5 min；变性95℃20 s，退火62℃30 s，延伸72℃20 s，所有基因均为40个循环；终末延伸72℃2 min。基因引物上下游序列及退火温度见表1。

表1　引物序列及退火温度Table 1　Sequences of the primers and annealing temperature

1.8Western-blot检测GSK-3β蛋白质水平

各组细胞抽提蛋白质，BCA法测定蛋白质浓度。各组样品按40 μg/孔点样，质量分数12.5% SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，半干法转蛋白质至PVDF膜。体积分数5%BSA TBST液在室温条件下封闭60 min。GSK-3β抗体（体积比1∶1 000）、p-Ser9GSK-3β抗体（体积比1∶1 000），4℃孵育过夜。洗涤后二抗室温孵育60 min。显色，成像，电泳图像分析系统分析。

1.9数据处理与统计方法

采用SPASS17.0统计软件对数据进行相关性分析，并作Duncan多重比较。实验数据用x±SD表示，显著水平为P＜0.05。

2　结果与分析

2.1α-LA对细胞内ROS的影响

随着葡萄糖浓度的增加，细胞ROS水平逐渐升高，且差异显著（P＜0.05）；添加200 umol/L α-LA可显著降低22 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖组ROS水平（P＜0.05），且22 mmol/L葡萄糖组可恢复至正常水平。如图1所示。

图1　各组细胞存活率及ROS水平的影响Fig.1　Influence of α-LA on ROS and the viability of RIN-m5F treated with glucose

2.2细胞SOD活性、MDA水平以及T-AOC的变化

随着葡萄糖浓度的增加，细胞内MDA水平显著升高（P＜0.05），SOD、T-AOC显著降低（P＜0.05）；而α-LA干预可显著提高各组SOD活性（P＜0.05），22 mmol/L葡萄糖+α-LA组可恢复至正常水平；此外，添加α-LA后可提高22 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖组T-AOC水平，降低MDA含量（P＜0.05），表明LA可有效降低高糖引起的氧化应激，见表2。

2.3细胞BAX和BCL-2 mRNA表达水平的变化

随着葡萄糖浓度的增加，BAX mRNA表达水平显著上调（P＜0.05），BCL-2 mRNA表达水平显著下调（P＜0.05）；添加α-LA后可在一定程度恢复22 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖组BCL-2表达水平，降低BAX表达水平（P＜0.05），表明LA具有一定的抗凋亡作用，如图2所示。

表2　各组细胞MDA、SOD和T-AOC水平的比较Table 2　Effects ofα-LA on MDA content，SOD activities and T-AOC in RIN-m5F treated with glucose

图2　各组细胞BAX-2mRNA表达的变化Fig.2　Expression of BAX-2 gene in different groups

2.4线粒体膜电位变化

随着葡萄糖浓度的增加，线粒体膜电位显著下降（P＜0.05）；α-LA干预后，各组相比损伤组线粒体膜电位均有显著升高（P＜0.05），且22 mmol/L葡萄糖+α-LA组可恢复至正常水平，如图3、4所示。

2.5α-LA干预对GSK-3β mRNA表达水平及蛋白质磷酸化水平的影响

α-LA对各组细胞GSK-3β基因水平的影响如图5所示，GSK-3β mRNA表达水平随葡萄糖浓度增加而提高（P＜0.05）；α-LA干预可显著降低糖损伤组GSK-3β mRNA表达水平，其中22 mmol/L葡萄糖组可下调至正常水平。

Western-blot检测细胞GSK-3β磷酸化水平，结果如图6和图7所示，随着葡萄糖浓度的升高，GSK-3β Ser9位点磷酸化水平显著降低（P＜0.05）；α-LA干预后，相比损伤组Ser9位点磷酸化水平均有显著升高（P＜0.05）。

3　讨论

Brownlee的统一机制学说认为，在高糖环境，线粒体呼吸链生成过多氧自由基可激活晚期糖基化终末产物途径、多元醇途径，以及蛋白激酶C途径，后者反过来又能促进自由基的生成，形成恶性循环［15］。

图3　α-LA对RIN-m5F细胞线粒体膜电位的影响Fig.3　Influence of α-LA to the mitochondrial membrane potential of RIN-m5F cell

图4　α-LA对RIN-m5F细胞线粒体膜电位的影响Fig.4　Influence of α-LA to the mitochondrial membrane potential of RIN-m5F cell

图5　各组细胞GSK-3β mRNA表达的变化Fig.5　Expression of GSK-3β gene in different groups

图6　western-blot检测各组细胞p-GSK-3β蛋白水平表达Fig.6　western-blot of p-GSK-3β protein in different groups

图7　western-blot检测各组细胞p-GSK-3β蛋白表达灰度值Fig.7　western-blot of p-GSK-3β protein in different groups

胰岛β细胞功能紊乱是糖尿病发生的中心环节，由于β细胞抗氧化系统处于较低水平，使其更易发生氧化应激，诱导细胞凋亡及胰岛素分泌功能降低［16］。正常生理状况下，胞内ROS生成和清除处于动态平衡，ROS过多生成引起细胞氧化损伤。

MDA是细胞膜脂质被活性氧氧化的产物，是评价氧化损伤程度的重要标志物，其过度累积可直接反映受氧化应激损伤的程度［17］。SOD是细胞受到外界刺激产生的内源性抗氧化酶类，可以清除活性氧物质，对维持氧化与抗氧化平衡起着重要作用，通过检测SOD活性可间接反映胞内氧化应激水平［18］。本研究中以11、22、44 mmol/L葡萄糖分别孵育RIN-m5F细胞72 h，发现高糖可诱导细胞产生氧化应激，且与糖浓度呈正相关。200 μmol/L α-LA干预可使高糖组细胞MDA和ROS生成显著降低，SOD活性及T-AOC水平显著升高。表明α-LA对RIN-m5F细胞的抗氧化保护作用，与调节抗氧化酶活性、增强总抗氧化能力有关。

糖原合成酶激酶GSK-3β是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在生物体内参与多种蛋白质的转录与激活，以及调控细胞增殖、分化和凋亡等生命活动的信号转导，具有广泛的细胞调节作用。研究发现，ROS升高导致GSK-3β Ser9位点磷酸化水平降低，从而激活GSK-3β，造成线粒体内Ca2+外流，线粒体膜电位改变，PTP通道打开。激活后的GSK-3β能够促进线粒体促凋亡蛋白质BAX表达［10］。BAX是BCL-2家族的重要蛋白质之一，正常条件下BCL-2与BAX形成异源二聚体，抑制BAX的功能。当BCL-2减少时，释放出来的BAX形成同源二聚体，在线粒体外膜形成足够让凋亡蛋白质传输的孔道，使线粒体膜电位破坏，造成线粒体膜电位下降，诱导细胞凋亡。王俐［19］等研究发现，α-LA可以抑制高糖诱导的ECV304细胞线粒体膜电位降低，保护细胞免受氧化损伤。Yoshiki Koriyama［14］等指出，LA可以通过抑制GSK-3β的表达对抗BV-2细胞炎症反应，为神经病变性疾病提供依据。但α-LA能否调节胰岛细胞GSK-3β活性，尚未见相关报道。本研究结果显示，高糖可以显著诱导RIN-m5F细胞凋亡，上调GSK-3β mRNA表达水平，下调GSK-3β Ser9位点的磷酸化水平，激活GSK-3β活性；α-LA干预后，GSK-3β mRNA水平显著下调，GSK-3β Ser9位点的磷酸化水平显著上调，并且伴随Bax mRNA表达水平下调及BCL-2 mRNA水平上调，线粒体膜电位显著升高，其中200 μmol/L α-LA可使22 mmol/L葡萄糖组各项指标恢复至正常水平。表明α-LA可能通过抑制GSK-3β活性调节线粒体BCL-2表达，从而抑制BAX释放，进而提高线粒体膜电位，抑制高糖诱导的细胞凋亡，维护细胞氧化还原稳态。

4　结语

综上，推测GSK-3β可能是α-LA保护高糖损伤胰岛细胞的一个重要信号分子，α-LA可能通过提高GSK-3β Ser9磷酸化水平抑制其活性，从而降低促凋亡蛋白质表达，提高线粒体膜电位，维护RIN-m5F细胞氧化还原稳态。

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Cytoprotective Effect of α-Lipoic Acid on RIN-m5F Cultured with High Glucose

GAO Cuicui1，TANG Xue1，2，LIN Yi1，CHEN Lili1，SHI Yonghui1，2，LE Guowei*1，2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The aim of this study is to investigate whether α-lipoic acid（α-LA）prevents high glucose-induced oxidative damage and apoptosis of pancreatic islet beta cells.In the present sudy，RIN-m5F cells were incubated with different concentration of glucose（11 mmol/L，22 mmol/L and 44 mmol/L）in the presence or absence of 200 μmol/L α-LA for 72 h.Then，cellular reactive oxygen species（ROS）levels，malandialdehyde（MDA）levels，total antioxidant capacity（T-AOC）and superoxide dismutase（SOD）activity were assayed with the appropriate test kits；mitochondrial membrane potential was detected by flow cytometry；relative genes levels were analyzed by reverse transcriptase polymerase chain reaction；western blotting was used to determine protein expression of GSK-3β and p-GSK-3β（Ser9）.The results show that α-LA significantly reduced the MDAformation and inhibited the ROS production induced by high glucose，whereas increased T-AOC and SOD activity.Additionally，α-LA induced membrane depolarization and increased mitochondrial membrane potential.These effects were mediated by Bcl-2 associated X protein（BAX）and B-cell lymphoma-2（BCL-2）expression.Western blotting indicated that α-LA inhibited GSK-3β by increasing p-GSK-3β（Ser9）level.Therefore，our data suggest that α-LA can effectively attenuate high glucose-induced RIN-m5F cell oxidative damage and apoptosis，by mechanisms which probably involves the inactivation of GSK-3β by phosphorylation.These findings provide a new interpretation on the role of α-LA in the treatment of diabetes.

α-lipoic acid，glucose，oxidative stress，apoptosis

TS 201.2

A

1673—1689（2015）09—0949—07

2014-06-04

国家“十二五”科技支撑计划项目（2012BAD33B05）；江苏高校优势学科建设工程资助项目。

乐国伟（1956—），男，浙江宁波人，农学博士，教授，博士研究生导师，主要从事营养代谢与调控研究。E-mail：lgw@jiangnan.edu.cn