半滑舌鳎腹水症病原的分离鉴定



半滑舌鳎腹水症病原的分离鉴定

徐晓丽，尤宏争，宋昀鹏，钟文慧，李贺密*

（天津市水产技术推广站，天津300221）

摘要：从患病半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）内脏及腹水中分离到优势菌株8301，回归感染试验证实菌株8301对半滑舌鳎具有致病性；采用形态学观察、生化特性分析、16S rDNA基因序列分析等方法对所分离菌株进行鉴定。结果表明，菌株8301为革兰氏阳性球菌，生化特性与海豚链球菌（Streptococcus iniae）较为接近，以16S rDNA基因为遗传标记构建系统发育树将菌株8301与海豚链球菌聚为一支，置信度为96%。结果判定引起此次半滑舌鳎腹水病的病原菌为海豚链球菌。对24种抗菌药物敏感性分析试验证实菌株8301对制霉菌素、利福平、青霉素、阿奇霉素等敏感，对罗红霉素、呋喃唑酮等具有抗性。

关键词：半滑舌鳎;腹水症;海豚链球菌; 16S rDNA

网络出版时间2015-3-13 15:23:00

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150313.1523.010.html

徐晓丽,尤宏争,宋昀鹏,等.半滑舌鳎腹水症病原的分离鉴定[J].东北农业大学学报, 2015, 46(3): 74-80.

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，俗称牛舌头、鳎米、鳎目等，是暖温性近海大型底层鳎类。该鱼肉质鲜美，营养丰富，生长快，出肉率高，适温范围广，是我国北方重要工厂化养殖品种之一，市场价格高。然而近年来在高密度、集约化循环水养殖模式下，病害问题日益严重。2011年以来天津地区养殖半滑舌鳎陆续出现烂鳍、腹水、体表溃烂、内脏白点等症状，尤其是腹水症，造成高死亡率，损失严重，产量和养殖面积急剧减少，已成为制约半滑舌鳎产业发展重要因素之一。

对半滑舌鳎腹水症，尚无统一病名，多种病原均可引起半滑舌鳎腹水症状。国内学者对半滑舌鳎腹水症相关报道中，张晓君等采集江苏连云港市发生出血及腹水症的半滑舌鳎进行病原分离鉴定，认为该病是由鳗利斯顿氏菌（Listonella an⁃guillarum）引起[1]；陈政强等从患赤皮及腹水症的半滑舌鳎体内分离到轮虫弧菌（Vibrio rotiferianus）及哈维氏弧菌（V. harveyi）[2]，人工感染试验证实这两株菌均可独立引起半滑舌鳎发病；张正等在出现腹水症状的半滑舌鳎肾脏和肝脏组织中发现病毒粒子存在[3]。本研究采集患腹水症的半滑舌鳎，从病鱼内脏及腹水中分离细菌，对分离到的优势菌株进行生化特性鉴定、致病性分析及菌株PCR鉴定，以16S rDNA为遗传标记构建该菌系统发育树，探明本次腹水症病原。本研究可丰富半滑舌鳎疾病研究资料，并通过分析所分离菌株药敏特性，为半滑舌鳎腹水症治疗提供参考。

1　材料与方法

1.1试验鱼来源

患腹水症的半滑舌鳎取自天津汉沽某工厂化养殖公司，体长约15~28 cm。回归感染试验用健康半滑舌鳎购自天津市海升水产养殖公司，体长（16±2）cm，体质量（34±3）g，暂养于75 L塑料整理箱中，30尾·箱-1，试验期间采用充气泵充氧，保持水温24℃，盐度2.2%，日投饵2次，暂养7 d后进行人工感染试验。

1.2病原菌分离

取患病半滑舌鳎，酒精棉球擦拭鱼体表，以无菌注射器从病鱼腹腔内抽取腹水，涂布于BHI培养基平板；取接种针灭菌后刺入病鱼肝、肾等病变组织接种细菌，划线接种于BHI平板，置于28℃恒温培养箱培养24 h，观察菌落形态特征，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，编码8301，将纯培养的菌液用BHI冻存液（含15%甘油的BHI液体培养基）保存于-80℃备用。

1.3回归感染试验

将分离到的菌株8301接种于含10%新生牛血清的BHI液体培养基中培养过夜，收集菌液以0.01 mol·L-1无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，调整菌悬液密度分别为3×108、3×107、3×106和3×105cfu·mL-1，用于感染试验。

感染试验用健康的半滑舌鳎分5组，饲养于50 cm×40 cm×35 cm玻璃缸中，每组10尾，其中1组为对照组。感染试验采用腹腔注射方式进行，试验组每尾注射0.1 mL不同密度菌悬液，对照组注射等量无菌PBS。试验周期为14 d，期间正常投喂换水，每天观察鱼的状态，记录发病和死亡情况，另取濒死鱼再次进行细菌分离鉴定。

1.4病原菌鉴定

1.4.1形态与生化特性鉴定

将菌株8301划线接种于BHI平板，观察其菌落特征，挑取单菌落制作细菌涂片做革兰氏染色，观察菌体形态。生化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌学鉴定手册》[4-5]，取纯化后的细菌接种于生化鉴定管（购自杭州天和微生物有限公司），进行生化特性鉴定。

1.4.2 16S rDNA基因序列扩增

挑取纯化后的菌株8301单菌落于DEPC水中，沸水煮5 min，瞬时离心后取上清作为PCR反应模板。16S rDNA基因序列扩增参照文献[6]进行，PCR扩增产物交由上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.4.3菌株8301的PCR鉴定

菌株8301的PCR鉴定参照Zlotkin等所建立方法[7]，采用特异性引物扩增海豚链球菌16S rD⁃NA保守序列，以海豚链球菌作为阳性对照，以无乳链球菌和哈维氏弧菌作为阴性对照，扩增结束后取5 μL PCR产物进行琼脂糖电泳，观察结果。

1.4.4 16S rDNA基因序列分析

将测序所得16S rDNA基因序列提交至Gen⁃Bank数据库中进行序列比对，根据返回结果从GenBank中选择同源性较高的细菌16S rDNA基因序列，采用Clustalx软件比对，用系统发育分析软件Mega 5.2基于邻接法（Neighbor-joining，NJ法）构建以16S rDNA为遗传标记的系统发育树，Boot⁃straps重复检验1 000次。1.5药敏试验

药敏试验采用纸片扩散法（Kindy-Bauer，KB法）进行。调整菌株8301菌液的麦氏浓度至0.5，均匀涂布于培养基平板，用无菌镊子将不同药敏纸片紧贴于培养基表面，将该平板置于28℃培养箱中培养18 h，记录各个药敏纸片的抑菌圈直径（mm）。根据抑菌圈直径大小以及药敏纸片的产品说明，判定该菌株对抗生素的敏感性。

2　结果与分析

2.1病鱼临床症状

病鱼反应迟钝，不食，在水中呈螺旋式游动，时而狂游，体色变浅，腹腔肿胀有腹水，鳃小片充血水肿，眼睛充血发红或浑浊发白，肠壁极薄，肠道内充满清亮的液体（见图1）。解剖发现肝脏发白或呈血红色，脾脏肾脏均呈鲜红色。取鳃、体表粘液及病变组织制作水浸片显微镜下观察，未发现真菌及寄生虫。从病鱼腹水及肝脏、肾脏中分离到优势菌株8301，转接到血平板上培养，形成明显的β溶血环。

图1　患病的半滑舌鳎症状Fig. 1　Symptoms of diseased Cynoglossus semilaevis

2.2人工感染试验

以纯培养的菌株8301菌液感染健康的半滑舌鳎，在感染3 d后开始出现游泳异常、旋转狂游等行为，4 d后开始出现死亡，至14 d感染试验结束，注射菌液浓度为3×107cfu·mL-1以上的试验鱼全部死亡，而对照组无一死亡，未表现明显异常（见表1）。感染死亡的病鱼，腹部明显隆起内有腹水，肝脏发白或呈血红色，脾脏、肾脏呈鲜红色，肠道无食，与自然感染状态相似。从人工感染后发病的濒死鱼内脏及腹水接菌划线于BHI平板，得到与菌株8301一致的具有β溶血活性的白色菌落，革兰氏染色显示形态与菌株8301一致，说明菌株8301是导致半滑舌鳎腹水症的病原菌。

表1　菌株8301的人工感染试验结果Table 1　Results of artificial infection of strain 8301

2.3病原菌常规鉴定结果

菌株8301菌落呈白色圆形，湿润，边缘整齐不透明，菌株生长较慢，在BHI平板上28℃培养24 h后，菌落直径为0.1~0.3 mm。菌株8301为革兰氏阳性球菌，直径0.6~0.8 μm，呈长短不一的链状排列（见图2）。菌株8301不运动，氧化酶与接触酶均为阴性，吡咯烷酮-β-萘胺（PYRA）阳性，聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）与β-半乳糖苷酶为阴性，水解马尿酸盐、七叶灵，具精氨酸脱羧酶活性，能够利用蔗糖、簟糖、葡萄糖、甘露醇、核糖、水杨甘、半乳糖发酵产酸，不能利用阿拉伯糖、棉籽糖、乳糖等，生化特性与海豚链球菌较一致（见表2），初步判定菌株8301为海豚链球菌（Streptococcus iniae）。

图2　菌株8301的菌落和菌体形态Fig. 2　Colony and cell morphology of strain 8301

表2　菌株8301和海豚链球菌的生理生化特征的比较Table 2　Comparison of physiological and chemicalcharacteristics of strain 8301 and S. iniae

2.4 16S rDNA基因序列分析

以16S rDNA通用引物B27F及1492R扩增菌株8301的16S rDNA基因序列，得到约1 500 bp基因片段（见图3），测序后将该序列与GenBank中已提交的16S rDNA基因序列进行比对分析，结果显示菌株8301与海豚链球菌（DQ303187.1）的16S rD⁃NA基因序列高度一致，相似度为99.86%。选取相关性较高的10余株细菌的16S rDNA基因序列运用Clustal 1.81软件进行多重序列比对分析，并采用Mega 5.2软件基于N-J法构建的系统发育树将菌株8301与海豚链球菌（DQ303187.1、AB593340.1）聚为一支，置信度为96%（见图4），而采用已建立的海豚链球菌PCR方法特异性扩增该菌16S基因的保守区域，得到预期300 bp的目的片段（见图3）；进一步证实所分离菌株8301为海豚链球菌。由此再结合菌株8301的形态及生理生化特性，鉴定菌株8301为海豚链球菌。

图3　菌株8301 16S rDNA基因扩增及PCR鉴定结果Fig. 3　Results of strain 8301 16S rDNAamplification and PCR identification

2.5药敏试验

在供试的24种抗生素中，菌株8301对制霉菌素、利福平、青霉素、阿奇霉素等7种药物敏感，对强力霉素、氟苯尼考、杆菌肽等5种药物中度敏感，对罗红霉素、恩诺沙星、磺胺异噁唑、呋喃唑酮、诺氟沙星、红霉素等12种药品表现出抗性（见表3）。

图4　以16S rDNA基因构建的链球菌系统发育树Fig. 4　Phylogenetic relationship among the Streptococcus species based on analysis of 16S rDNA gene sequences

表3　菌株8301药敏试验结果Table 3　Results of sensitivity test to strain 8301

3　讨论与结论

鱼类链球菌病在世界范围内能够危害多种海淡水养殖鱼类，尤其是集约化养殖鱼类，传播快，短时间内可造成大批鱼类死亡，带来严重经济损失，是鱼类最重要的致病菌之一。引起鱼类链球菌病的病原主要有海豚链球菌（S. iniae）、无乳链球菌（S. agalactiae）、副乳房链球菌（S. parau⁃beris）、停乳链球菌（S. dysgalactiae）、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）等，不同链球菌引起的疾病表现出的症状相似，如败血症、脑膜炎等[7]。其中海豚链球菌具有最广泛的宿主范围，自1976年发现以来，先后在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、罗非鱼（Oreochromis speices）、牙鲆（Paralichthys oliva⁃ceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、澳洲肺鱼（barramundi）、银鼓鱼（Selenotoca multifasciata）、斑马鱼（Danio rerio）、红拟石首鱼（Sciaenops ocel⁃latus）、斑点叉尾鲤回（Ictalurus punctatus）、美国红鱼（Sciaenops ocellatus）等至少27种养殖和野生鱼类中发现海豚链球菌，同时该菌可在不同种鱼类之间交叉传播，危害巨大，引起重大损失遍及美国、以色列、南非、日本、澳大利亚、中国、菲律宾、台湾等国家和地区[8-14]。

本研究首次从患腹水症的半滑舌鳎内脏及腹水中分离到优势菌株8301，经形态学、生化特性分析、16S rDNA基因序列分析鉴定为海豚链球菌，丰富海豚链球菌研究资料；回归感染试验证实菌株8301对半滑舌鳎具有较强致病性，注射浓度为3×105cfu·mL-1菌液，即可引起70%死亡率，为此次半滑舌鳎腹水症的致病菌，但本次人工注射感染的鱼并未出现肠壁薄内充无色清液的症状，可能由于病原毒力强、鱼类急性死亡导致，准确的菌株8301的半数致死量，还需进一步试验验证。

海豚链球菌在链球菌属中较为特殊，传统的Lancefield链球菌血清型不能将其进行准确分组，不同地理株系又在生化特性上存在一定差异，以致曾被鉴定为另一新种“Streptococcus shiloi”[15-16]。本研究中对海豚链球菌生化特性的比较分析，除参考伯杰氏细菌系统鉴定手册（9thed.），还借鉴从不同宿主获得的多个海豚链球菌分离株的生化特性，认为本次所分离菌株8301的生化特性与海豚链球菌最为接近[5, 8-12]。分子生物学鉴定近年来广泛应用于水生动物病原菌的分类和鉴定中，其中16S rDNA基因是在进化上最为保守的基因之一，由高度保守区和可变区组成，遗传稳定，对细菌鉴定具有重要价值。

本研究扩增菌株8301的16S rDNA基因序列并进行测序，从同源比对及聚类分析结果来看，菌株8301的16S rDNA基因序列与海豚链球菌（DQ303187.1）同源性最高，在系统发育树上与海豚链球菌聚为一支。因此结合形态特征、生化特性和分子生物学水平鉴定，确定菌株8301为海豚链球菌。另外本研究还应用Zlotkin等[7]报道的海豚链球菌核糖体RNA基因特异性引物进行分离株16S rDNA基因保守片段的扩增，得到预期300 bp长度的基因片段，由此进一步确定菌株8301为海豚链球菌。

对于海豚链球菌引起的疾病，宜通过药敏试验选择最有效的抗生素用于治疗，但药敏试验受试验条件和时间限制，筛选能力有限，生产上多是凭经验用药。一般认为，海豚链球菌对红霉素、万古霉素敏感[11, 14]，罗璋等从银鼓鱼分离的菌株对恩诺沙星、罗红霉素、强力霉素、四环素、左氟沙星均敏感[9]，陈德芳分离的海豚链球菌株对强力霉素、红霉素、万古霉素、恩诺沙星、诺氟沙星敏感，而对青霉素不敏感[10]，沈智华所分离的海豚链球菌菌株对先锋V、氨苄青霉素、青霉素、万古霉素敏感[10]；本研究所分离菌株8301对青霉素敏感，对强力霉素、四环素中度敏感，对诺氟沙星、恩诺沙星、红霉素、罗红霉素具有抗性。不同分离株药物敏感性差异可能与各地区抗生素使用及细菌耐药性的产生有关。而海豚链球菌为革兰氏阳性菌，且为白细胞内“寄生菌”，国标渔药中规定的抗生素类药物中，抗革兰氏阳性菌的药物非常少，如本研究中，对菌株8301敏感的阿奇霉素、青霉素、左氟沙星、庆大霉素等，均不在国标渔药之列，且常规5~7 d的用药疗程也无法达到良好的疗效。

对于鱼类链球菌病，预防比治疗更为重要，在日常养殖过程中，降低养殖密度、规范饲养管理、合理使用微生态制剂、严控苗种质量、适当投喂免疫增强剂、减少鱼体应激、及时采取有效消毒与隔离措施等均能有效降低疾病发生机率[17]。此外疫苗使用也可有效预防该病发生。以色列、日本、西班牙等国已采取注射链球菌疫苗方式预防鱼类链球菌感染，美国研制的海豚链球菌灭活疫苗在罗非鱼免疫保护试验中取得很好保护效果，尤其是腹腔接种疫苗，相对保护率可达93.2%。商业化疫苗格氏乳球菌和海豚链球菌二联苗经检测对虹蹲可产生3~6个月的免疫保护力[18]。但由于海豚链球菌不同血清型的出现以及细菌表面抗原漂变，灭活疫苗最好采集当年、当地发病鱼样本制作。目前，国内广西水产研究所和中山大学均在研制罗非鱼海豚链球菌疫苗，中科院海洋研究所构建牙鲆源海豚链球菌Sip11重组亚单位疫苗，并申请专利，但生产应用还需较长一段时间。

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Xu Xiaoli, You Hongzheng, Song Yunpeng, et al. Isolation and identification of pathogenic bacterium associated with ascites in Cynoglossus semilaevisis[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(3): 74-80. (in Chinese with English abstract)

Isolation and identification of pathogenic bacterium associated with

ascites in Cynoglossus semilaevisis/XU Xiaoli, YOU Hongzheng, SONG Yunpeng,

ZHONG Wenhui, LI Hemi (Tianjin Fishery Technical Extension Department, Tianjin 300221, China)

Abstract:Dominant bacteria designed as 8301 was isolated from ascites and kidney of diseased Cynoglossus semilaevisis and proved to be pathogenic strongly to C. semilaevisis by artificial challenge. The biological characteristics including morphological, physiological and bio-chemical characteristics were examined, and the 16S rDNA gene were partially sequenced and compared with sequences deposited in Gen-Bank databases. The results showed that strain 8301 appeared gram-positive cocci in chains; based on the physiological and biochemical characteristic analysis, strain 8301 was identified as Streptococcus iniae. Phylogeny analysis with 16S rDNA showed that strain 8301 was branched into the same cluster of S. iniae and the bootstrap was 96%. These results determined that the pathogen of causing ascites in C. semilaevisis was S. iniae. Antimicrobial susceptibility assay showed that strain 8301 was susceptible to nystatin, rifampicin, penicillin and azithromycin, but resistant to roxithromycin, furazolidone, etc.

Key words:Cynoglossussemilaevis; ascites; Streptococcusiniae; 16S rDNA

*通讯作者：李贺密，高级工程师，研究方向为水产养殖。E-mail: scjstgz688@163.com

作者简介：徐晓丽（1983-），女，工程师，博士，研究方向为水产动物病害与免疫学。E-mail: xiaolixu1983@gmail.com

基金项目：天津市科技支撑计划项目（12ZCZDNC00900）；天津市科委科技计划项目（13ZXNZNC07700）

收稿日期：2014-06-14

文章编号：1005-9369（2015）03-0074-07

文献标志码：A

中图分类号：S941.1