食品中荧光假单胞菌的危害及其快速检测方法研究进展

高　　琳，陈万义，任　　婧，*

（1.光明乳业股份有限公司光明乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海200436；2.上海海洋大学食品学院，上海201306）

食品中荧光假单胞菌的危害及其快速检测方法研究进展

高琳1，2，陈万义1，任婧1，*

（1.光明乳业股份有限公司光明乳业研究院，乳业生物技术国家重点实验室，上海200436；2.上海海洋大学食品学院，上海201306）

荧光假单胞菌（Pseudomonas Fluorescens）隶属于假单胞菌属，是食品中常见的一种嗜冷致病微生物。它能够产生极其耐热的蛋白酶和脂肪酶，这些酶在高温处理后仍有残留，并在食品储藏过程中继续分解其中的脂肪和蛋白质，导致产品的风味和质地发生变化。因此，研发出一种既快速又实用的荧光假单胞菌检测方法成为食品行业关注的焦点。本文对食品中荧光假单胞菌的危害特点及国内外的一些快速检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）、荧光定量PCR、荧光原位杂交、流式细胞术等方法进行了综述，比较各方法的优缺点并展望了荧光假单胞菌快速检测方法的发展趋势。

荧光假单胞菌，危害，快速检测方法，食品

食品安全问题是当今国际社会的热点话题，食源性疾病的发病率处于各类疾病发病率的前列，严重影响公共健康。随着经济的发展和人民生活水平的日益提高，我国的食品安全问题也越来越受重视。

荧光假单胞菌（Pseudomonas Fluorescens）是属于假单胞菌属（Pseudomonas）的嗜冷微生物，它是一种环境污染菌，广泛存在于水和土壤当中。它能够在低温环境下生长繁殖，冷藏的牛奶、高蛋白以及脂类丰富的食品一旦被荧光假单胞菌感染，该菌便会大量繁殖，逐渐演变为优势菌群［1-2］。虽然经过巴氏杀菌（72℃，15 s）以及超高温灭菌（UHT）可以杀死荧光假单胞菌，但其产生和分泌的蛋白酶和脂肪酶非常耐热，即使是巴氏杀菌和UHT处理也不能使这些酶完全失活。残留的酶会导致牛奶的物理品质和感官品质发生变化。有临床研究表明，荧光假单胞菌自溶后会释放内毒素，内毒素中的磷脂成分若污染了血液制品，会导致病人输血后产生不可逆的休克［3］。随着人类社会电冰箱的普及，冷冻食品在人类的饮食构成中占据了极大的比例，嗜冷的荧光假单胞菌对于人类而言便是一种潜在的威胁。目前尚未有关于荧光假单胞菌导致食品中毒事件的报道，但是随着人们生活质量的提高，食品安全越来越引起人们的重视，如何能够快速的检测出食品中的荧光假单胞菌这一难题便被提上食品安全的日程。

1　荧光假单胞菌的生物学特征

荧光假单胞菌在分类学上属于假单胞菌属，菌体细胞为直的短杆状，大小为0.7～0.8×2.3～2.8 μm，两端圆形，无菌毛，不产芽孢，革兰氏染色阴性［4］。有数根极生鞭毛，利用鞭毛运动。荧光假单胞菌是好养或者兼性厌氧的，进行严格的呼吸型代谢，以氧为最终电子受体，但能以硝酸盐为替代的电子受体进行厌氧呼吸。其化能营养为异养，不需要有机生长因子。在酸性环境下几乎所有的种都不能生长。荧光假单胞菌不产脓青酶，氧化酶阳性，接触酶阳性，甲基红实验阳性，精氨酸双水解酶阳性，V.P实验阴性。荧光假单胞菌的生长温度范围为4～37℃，在4℃时繁殖最快，在42℃时就会停止生长，超过70℃，只需数秒即可被杀死。

荧光假单胞菌在自然界中分布广泛，土壤、水、植物［5］及动物活动环境中均能生存，在海洋环境中也普遍存在。常大量寄生在鱼类、两栖类、爬行类动物甚至一些昆虫的体内，其成员对动植物以及人类均具有致病性。荧光假单胞菌［6］常常存在于人的脓液、痰液、尿液、血液、胸腔积液和胆汁等，也是存在于人类肠道的正常细菌，但对正常人群不具有致病性。

2　荧光假单胞菌的流行病学特征

在临床上荧光假单胞菌最主要的危害是侵染血液及血制品。早在二十世纪五十年代，Pittman［7］和Brande［8］曾先后通过分析库存血液的污染菌，指出假单胞菌属（Pseudomonas）是最常见的污染菌。贺许华等［9］曾报道过献血者因携带荧光假单胞菌而污染库存血液的案例。荧光假单胞菌对正常人不具有致病性，但其一旦进入人体血液，可导致诸如败血症、感染性休克以及血管内凝血等严重后果。曾有报道指出，在2004～2006年，由于用于癌症病人的肝素化盐清洗液被污染，导致超过80人被感染了荧光假单胞菌［10］。

荧光假单胞菌的致病性主要归因于其释放的内毒素，内毒素的磷脂成分可以引起细菌性休克以及弥漫性血管内凝血［11］。它能导致先天性或者获得性免疫缺陷症的病人罹患骨髓炎、败血症、化脓性关节炎、泌尿道及肺部感染等多种疾病。此外，荧光假单胞菌也是水生经济动物的条件致病菌，可引发草鱼、青鱼、鲤鱼、鲫鱼等大多数淡水鱼类的赤皮病，也能引起热带鱼、鲑科鱼类和多种鱼类的细菌性败血病和赤皮病［12］。

3　荧光假单胞菌对食品的危害

从低温冷藏条件下的原料乳中分离出的嗜冷菌以荧光假单胞菌为主［13］，通过对鲜乳中易污染的嗜冷菌进行分离鉴定与相关研究，已经成功分离出荧光假单胞菌［14］。张阳旸等［15］经过一年的采样与筛选，发现上海地区原料乳分离出的嗜冷菌中，假单胞菌属细菌占了58%，其中荧光假单胞菌是牧场检出率最高以及检出月份最多的嗜冷菌。这些从冷藏原料乳中分离出的嗜冷荧光假单胞菌会产生胞外碱性蛋白酶，该酶会导致牛乳黏度增加、凝集以及乳清析出，牛乳品质显著下降［16］，虽然通常巴氏杀菌工艺（72℃，15 s）可以将荧光假单胞菌杀死，但是荧光假单胞菌分泌的胞外耐热性蛋白酶可以耐受超高温瞬时灭菌（137℃，4 s）而存活，通常情况下大约会有10%的残留。这些残留将在奶制品储藏过程中再次被激活，分解蛋白质和脂肪，从而导致乳制品物理品质和感官品质发生变化［17］，如出现苦味、腐败味、脂肪氧化味或老化产生胶凝等一系列质量问题。这些品质变化明显缩短乳品的保质期，不仅严重阻碍乳品产业的发展，而且会导致经济损失。

4　检测方法概述

荧光假单胞菌不仅危害人类及动物的健康，而且会缩短食品的货架期，造成经济损失。因此能够快速并准确的检测出食品中的荧光假单胞菌具有良好的实践意义。

4.1传统检测方法

通常研究荧光假单胞菌在周围的分布，主要采用电镜扫描（SEM）、绿色荧光蛋白（GFP）标记细胞以及免疫化学的方法［18］。鱼类荧光假单胞菌的传统诊断方法包括病原分离培养和血清学检测，但这些检测方法无法快速并准确的检测出食品中的荧光假单胞菌。

目前国内对荧光假单胞菌的检测鉴定仍然以传统培养方法为标准。在食品工业，检测和鉴别荧光假单胞菌的方法主要是传统的生理生化分析，基本步骤大致为样品前处理、选择性増菌、选择性平板分离以及生理生化特征实验等，实验周期最少为4 d，检测时间长，重复性低［19］，而且生化分析检测范围小，仅限于检测几个品种［20］，该方法虽然具有实用性和准确性，但是生化诊断法常常依赖于荧光假单胞菌的表型表达，其表型表达的特点是随着环境的不同而表现出不同的表型，从而导致生理生化诊断的误判［21］。随着食品工业的发展及对高通量快速监测技术的追求，传统的检测方法显然不能适合当今科研和生产实践等工作要求。

4.2现代分子生物学检测方法

近些年，随着基因组学和分子生物学的发展，一些新型快速检测方法如聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），实时定量PCR，荧光原位杂交，流式细胞技术［22］等技术已经得到开发和应用。其中荧光原位杂交，流式细胞等技术能快速检测嗜冷的荧光假单胞菌，并能对活菌进行计数，可以达到和传统检测方法一致的结果。

4.2.1PCR检测方法聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。PCR反应自问世以来，因其具有特异性强、灵敏度高、操作简便且省时等特点而深受学者们的青睐，并已被广泛应用在食源性致病微生物的检测领域。

PCR方法是现阶段检测荧光假单胞菌最快速最有效的方法［23］。由于荧光假单胞菌的PCR检测尚处于起步阶段，且假单胞菌属是一个很大的群体，可以分为5个生物变型［24］，因此PCR检测过程中特异性引物很难设计［2，25］。检测靶点是分子检测法的关键，目前已经报道的检测靶点包括16S rRNA基因［26-27］、apr基因［28-29］、gyrB基因［20，30］以及国内邓显文等报道的16S-23S rRNA基因间隔区序列［31］（ITS1，intergenic spacer）。

4.2.2多重PCR结合微阵列荧光显色法DNA微阵列（DNA Microarray）也叫寡核苷酸阵列（Oligonucleitide array），它是在核酸杂交（Northern、Southern）的基础上发展起来的一项新技术，是生物芯片中的一种。其原理是在固体表面上集成已知序列的基因探针，被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交，通过检测相应位置杂交探针，实现基因信息的快速检测。DNA宏阵列（macroarray）是微阵列的技术基础，通过使用两组多重PCR技术进行显色宏阵列体系，可以快速检测出牛奶或肉类中的荧光假单胞菌。CHIANG Y等［32］通过设计DNA探针以及PCR引物，从牛奶及肉类食品中快速检测出了李斯特菌、金黄色葡萄球菌以及荧光假单胞菌等细菌。这种宏阵列体系包括两个步骤，首先是多重PCR引物实验，然后是显色DNA宏阵列，通过使用两组多重PCR系统和包含对荧光假单胞菌特异性探针的宏阵列，为检测出荧光假单胞菌，CHIANG Y等建立的特异的杂交模式，可以在18 h内检测出荧光假单胞菌，此法不需使用琼脂糖凝胶电泳，避免了琼脂糖凝胶电泳不能识别出分子量接近的PCR产物的不足。宏阵列法检测食品中的荧光假单胞菌精确快速且省时，可行性高。

4.2.3荧光定量PCR检测法荧光定量PCR（realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR）是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程。通过结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR技术［33］在理论上优于常规PCR方法，检测速度更快，特异性更强，灵敏度更高，且可以实现对待测样品的定量检测。

近年来，荧光定量PCR方法已逐步取代常规PCR，成为食品安全与科学研究中PCR检测的研究趋势，广泛应用于各类病原菌的快速检测中。杨一林［23］选取gyr B基因为检测靶点，建立了常规PCR和荧光定量PCR检测体系，并进行了系统评价，经过特异性、灵敏度以及抗干扰能力评价，证实了建立的荧光定量PCR体系可快速、准确的检测食品样品中荧光假单胞菌的存在。但是RQ-PCR［34］这一技术的局限之处在于无法区分样品中的DNA是来自于活细胞还是死细胞。通过在DNA提取和扩增之前加入一种可以破坏死细胞完整性和DNA的染料，如EMA和PMA，从而抑制死细胞DNA的扩增。

4.2.4荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术［35］（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，基于碱基互补配对原则，与环境基因组中DNA分子杂交。通过识别杂交位点的荧光信号来对特定核苷酸序列进行定性、定量以及定位分析。相较于其他检测方法，FISH检测过程中无核酸提取及扩增过程，因而被认为是快速检测食品中微生物的重要方法之一。随着FISH技术的逐渐成熟，多色荧光原位杂交技术［36］（Multicolor Fluorescence In Situ Hybridization，MFISH）应运而生。Yamaguchi等［37］使用该技术在7 h内从牛奶中检测出了荧光假单胞菌。FISH技术的不足之处在于其荧光信号的强弱取决于染色体含量的高低，一旦染色体含量较低，则会导致假阴性的检测结果。此外，杂交探针的特异性也会对实验结果造成影响，特异性不足，则会导致假阳性现象。

4.2.5流式细胞术流式细胞术［34］（Flow Cytometry，FCM）是能够用来快速检测液相中悬浮粒子多种物理特性的一种现代分析方法。它是以流式细胞仪为工具，将悬浮液中的待测细胞荧光染色，通过强激光照射被染色的细胞，产生的光信号经光电分析器接受分析后转变为数学信号，从而对待测细胞进行定量分析［38］。Ruger等［39］利用流式细胞仪术从混合细菌中检测出荧光假单胞菌。此法的优点在于不需要对DNA进行提取和扩增，并且快速、灵敏且分析量大，在乳制品微生物的检测中应用广泛。但FCM的检测结果也受多种因素影响，如乳制品中存在的大颗粒物质如蛋白质、脂肪球等，这些大分子物质会干扰流式细胞仪的定位。为了提升检测灵敏度，可以在检测之前将这些大分子颗粒清除。

5　结论与展望

存在于食品中的荧光假单胞菌不仅影响食品的质量，造成经济损失，而且能够危害人类的健康。如何能够快速高通量的检测出食品中的荧光假单胞菌是食品安全领域迫切需要解决的问题。传统的检测方法不仅工作量大，耗时长，而且常常因为检测结果不准确而出现“假阳性”或者“假阴性”现象，导致资源浪费或者有害食品流入市场。利用分子生物学技术检测食品中的荧光假单胞菌克服了上述诸多问题，得到了越来越多学者的青睐。但是现代分子生物学方法依然存在各自的不足之处，随着食品工业的发展，迫切的需要建立出一种更加快速、灵敏度高且成本低廉的快速检测方法。只有更深入的研究，运用分子生物学方法快速检测出食品中的荧光假单胞菌才会成为可能。

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表3　角鲨烯对小鼠肝脏MDA、GSH含量的影响（±s，n=10）Table 3　Effect of squalene on MDA and GSH contents in mouse live（r±s，n=10）

表3　角鲨烯对小鼠肝脏MDA、GSH含量的影响（±s，n=10）Table 3　Effect of squalene on MDA and GSH contents in mouse live（r±s，n=10）

组别　　剂量（mg/kg）MDA（nmol/g）GSH（μmol/g）正常组　34.0±10.4　0.915±0.396模型组　74.9±27.9##　0.586±0.247#阳性组　350　46.1±26.4*　0.853±0.283*角鲨烯高剂量组　500　22.82±7.0**　0.896±0.375*角鲨烯中剂量组　250　44.6±24.1*　0.878±0.296*角鲨烯低剂量组　125　68.1±20.5　0.759±0.283

3　结论与讨论

短时期大量摄入酒精可引起急性酒精性肝损伤，研究表明氧化应激和脂质过氧化作用对酒精性肝损伤的发生、发展起着关键作用［8-9］。酒精进入人体后，大部分在十二指肠和空肠吸收，在体内代谢过程中产生过量的自由基，可导致肝细胞膜的脂质过氧化及体内GSH的耗竭［10］。在体内氧化还原系统中，GSH则是体内最主要的抗氧化成分；而MDA是脂质过氧化反应的终产物，其含量的多少直接反映了机体脂质过氧化损伤的程度。本研究结果显示，模型组小鼠肝组织MDA含量极显著（p＜0.01）增加，GSH水平显著（p＜0.05）降低，而角鲨烯能明显拮抗一次性大量摄入乙醇的小鼠肝脏MDA含量升高以及GSH水平的降低，其中以角鲨烯500 mg/kg的作用最为明显。过度摄入酒精可造成α-磷酸甘油增加，从而加强TG合成，导致TG蓄积，使血清TG水平升高［11-12］。本实验中急性酒精肝损伤模型能显著（p＜0.05）升高小鼠的TG含量，角鲨烯可有效降低因急性酒精肝损伤引起的TG含量升高，且高剂量作用明显。ALT、AST主要存在于肝细胞内，是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”，当肝细胞发生炎症、坏死等损伤时可释放到血液中，致使血清中的水平升高，因此ALT、AST是反应肝细胞损伤的敏感指标。角鲨烯可显著抑制急性酒精肝损伤引起的血清ALT、AST升高，且呈一定的剂量依赖性。

综上可知，角鲨烯对急性酒精性肝损伤具有显著的保护效果，其机制可能与角鲨烯抑制乙醇导致的肝细胞膜脂质过氧化，阻止MDA形成，避免肝功能的损害等有关。

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Research progress of hazards and rapid methods for detection of Pseudomonas Fluorescen in foods

GAO Lin1，2，CHEN Wan-yi1，REN Jing1，*
（1.StateKeyLaboratoryofDairyBiotechnology，DairyResearchInstitute，BrightDairy&FoodCo.，Ltd.，Shanghai200436，China；2.College of Food Science&Technolgy，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Pseudomonas Fluorescens belongs to Pseudomonas.It was a very common psychrotrophic pathogenic microorganisms in foods.It could produce some cellular enzymes with high thermal stability such as lipases and proteases.After treated at high temperature，these enzymes were still active and continue to decompose the fat and protein in foods.Therefore，recently more and more researchers focus the attention on the rapid and exact detection of Pseudomonas Fluorescens in foods.Some rapid detection methods were discussed in this paper，such as polymerase chain reaction（PCR），realtime fluores-cence quantitative PCR，fluorescence In situ hybridization and flow cytometry，and their advantages and disvantages were compared.At last，the research direction of Pseudomonas Fluorescens was discussed.

Pseudomonas Fluorescens；hazard；rapid detection method；food

TS207.4

A

1002-0306（2015）16-0373-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.068

2015－01－04

高琳（1991－），女，在读硕士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：wangyiIrene@163.com。

任婧（1980－），博士，高级工程师，研究方向：食品安全及微生物分子生物学，E-mail：animalrain@hotmail.com。

国家“十二五”科技支撑计划课题（2012BAD12B08，2012BAK17B14）。