近红外光谱技术快速无损检测蓝莓总黄酮、花青素的研究

刘小路，薛　璐，*，鲁晓翔，张　鹏，陈绍慧，李江阔

（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134；2.国家农产品保鲜工程技术研究中心，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津300384）

近红外光谱技术快速无损检测蓝莓总黄酮、花青素的研究

刘小路1，薛璐1，*，鲁晓翔1，张鹏2，陈绍慧2，李江阔2

（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134；2.国家农产品保鲜工程技术研究中心，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津300384）

为建立起蓝莓的快速无损检测体系，本研究应用近红外光谱技术对鲜蓝莓中总黄酮、花青素的含量进行了分析。在光谱全波长（400～2500 nm）范围内采用偏最小二乘法（PLS）建立蓝莓总黄酮、花青素含量的定标数学模型，其相关系数分别为0.836和0.750，校正标准误差（SECV）分别为1.423 mg/（100g）和4.688 mg/（100g）。然后使用最优模型对32个未知样品进行预测，其预测相关系数Rp2分别为0.7968和0.7902，预测标准误差分别为2.779 mg/（100g）和5.013 mg/（100g），残差和分别为-0.003 mg/（100g）和-9.256（mg/100g）。实验结果说明，近红外漫反射技术可用于快速无损检测蓝莓中总黄酮、花青素含量。

近红外光谱技术，蓝莓，总黄酮，花青素，无损检测

蓝莓（Blueberry）学名为越桔（Vaccinium ssp），属于杜鹃花科（Ericaseae）越桔属（Vaccinium）落叶或常绿灌木植物，果肉细腻，甜中带酸，风味独特，适于鲜食。蓝莓营养价值高，除含有糖、酸外，还富含多种维生素（VC、VE、VA、VB等）、SOD、熊果苷、花色苷、蛋白质、丰富的食用纤维以及黄酮类等特殊成分。蓝莓中黄酮类物质作为生物活性成分，在抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、延缓衰老、改善视力等方面有一定的作用［1］。

黄酮类物质及花青素等传统的检测方法有水浸提法、有机溶剂浸提法、回流提取法等，这些方法耗时长，污染环境，无法满足生产过程中在线成分含量监控的要求。因此简单、快速、高效的检测方法广泛受到关注。近红外光谱技术作为一种快速、无损的检测技术，在水果品质检测中得到了广泛的应用［2-6］。王姗姗等［7-8］曾利用近红外光谱技术对超低温贮藏（-170℃）的蓝莓进行无损检测，对蓝莓SSC、总酚和花青素建立数学模型。刘燕德等［9］应用可见/近红外漫反射光谱对南丰蜜桔维生素C含量进行了无损检测研究。虽然近几年近红外应用广泛，但是在鲜食蓝莓总黄酮、花青素含量测定方面的研究较少。本课题研究了低温贮藏（0℃）条件下，利用近红外光谱技术建立鲜食蓝莓总黄酮、花青素含量的无损检测模型，通过对模型的校正、验证，获得准确性较高的模型，为以后鲜食蓝莓的品质鉴定提供理论依据及方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

蓝莓品种伯克利，于2014年7月采自大连金州基地，采摘当天将果实运回国家农产品保鲜工程技术研究中心实验室（温度为25～30℃）进行处理。低温（0℃）预冷24 h后进行分装（0.05 mm的PE膜），封口，然后放在低温库（0℃）中贮藏，样品从采摘当天开始测定，到低温贮藏64 d蓝莓变软、腐烂率达到50%停止测定，其间每8 d进行测定，共测8次。

NIRSDS2500近红外漫反射光谱仪丹麦FOSS公司；TU-1810紫外-可见分光光度计普析通用仪器有限公司；SHZ-82A水浴恒温锅金坛市金南仪器制造有限公司。

1.2实验方法

1.2.1蓝莓样品处理实验前，将处理的蓝莓取出，置于常温环境下1.5 h，恢复至室温，每次实验取20组，每组4个果实。每组蓝莓标记后四果同时进行光谱扫描，然后将扫描后的蓝莓果实进行化学指标的测定。实验共取160个，随机分为定标集和验证集，样品数分别为128个和32个。

1.2.2光谱的采集本实验使用仪器是丹麦FOSS公司提供的NIRS DS2500近红外漫反射光谱仪，采用全息光栅分光系统，硅（400～1100 nm）和硫化铅（1100～2500 nm）检测器采集信号。光谱采集条件为：在波长范围400～2500 nm内，单波长快速扫描，扫描次数32。仪器配制Nova分析软件采集光谱，WinISI4定标软件处理光谱数据，测量时尽量避开表面缺陷部位（如伤疤、污点等），因蓝莓果实较小，光谱扫描时采用每组四果同时扫描，尽量将透光孔遮住，在小浆杯（Slurry Cup）上蓝莓果实均竖放，避开果蒂进行光谱扫描。

1.2.3测定方法

1.2.3.1样品液的制备每组四个蓝莓新鲜果肉各取一部分，共称取5 g左右，研磨后放于250 mL的烧杯中，用60%的乙醇定容至100 mL，摇匀，放在80℃的水浴锅浸提15 min，取出，放置至漂浮物沉下为止，备用。

1.2.3.2总黄酮含量的测定

a.标准曲线的制作：准确量取芦丁标准液（0.08 mg/mL）0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL于试管中，用30%乙醇定容至5 mL，混匀，分别加入0.3 mL 5%NaNO2，混匀静置5 min，加0.3 mL 10%Al（NO3）3，混匀静置5 min，加入4 mL 1 mol/L NaOH，再加入0.4 mL 30%乙醇使总体积达到10 mL，混匀静置10 min，在510 nm处比色，以蒸馏水为空白对照，制定标准曲线。

b.总黄酮含量的测定：取1 mL提取液，加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液，摇匀静置5 min，加入0.3 mL 10%的Al（NO3）3溶液，摇匀，放置5 min，加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液，用30%的乙醇定容到10 mL，混匀静置10 min。以蒸馏水作为空白对照，在其最大吸收波长510 nm处测定吸光度A值［10-11］。计算公式为：

其中：X—由回归方程求得；V1—提取液总体积；V2—测定用样品液体；W—样品鲜重。

1.2.3.3花青素含量的测定取制备的样品液两份，各2 mL，分别加入pH 4.5的0.4 mol/L的醋酸钠缓冲液和pH 1.0的0.25 mol/L的氯化钾缓冲液8 mL，摇匀，放置半小时，转入光路长1 cm的比色皿后，用紫外-可见分光光度计分别以530 nm和700 nm为吸收波长测定其吸光度，用60%乙醇做空白对照［12］。计算公式为：

其中：A—最终吸光度；M—摩尔质量：449.2；F—样品液稀释倍数；V—稀释总体积：mL；e—摩尔吸光系数：26900；L—比色皿光路长：1 cm；m—样品鲜重：g。

1.3光谱数据处理与分析

为了比较不同光谱预处理方法对所建模型的影响，利用WinISI4定标软件，对原始光谱进行滤波和平滑处理，以去除噪声，提取有效信息。本实验中总黄酮、花青素均采用PLS法，分别研究不同导数处理与不同散射和标准化方法相结合的处理方法对模型的影响，通过比较找到最优的模型。在全光谱范围内，讨论了原始光谱（None）、一阶导数（D1Log（1/R））、二阶导数（D2Log（1/R））和标准正常化处理（SNV）、去散射处理（Detrend）、标准正常化与去散射结合处理（SNV and Detrend）、标准多元离散校正（SMSC）和加权多元离散校正（WMSC）相结合的处理方法所建立的模型。然后再用未参与定标的未知样品对最优定标模型进行验证，以评价模型的可行性。本实验以交互验证相关系数（Rcv2）和交互验证误差（SECV）作为评价指标。预测模型则通过预测相关系数（Rp2）、预测标准误差（SEP）和残差分析评价所建模型的精确性。

1.4预测模型残差分析

预测效果和稳定性较好的近红外模型，要求残差正、负值均匀分布在零点上下，且残差之和接近于零。残差公式如下［13］：

残差e=y－y′

式中，y为通过数学模型预测所得的样品预测值；y′为用标准方法所得的样品真实值。根据残差分布和残差和确定定标模型的预测效果。

2　结果与讨论

2.1低温贮藏期间蓝莓总黄酮、花青素含量标准值

蓝莓在贮藏期间，随贮藏时间的延长，蓝莓中的化学成分在相关酶的作用下发生变化，导致果实中含氢官能团变化。研究表明，近红外光谱区吸收的官能团主要是含氢官能团，其中包括C-H、O-H、N-H和S-H等，一般情况下近红外光谱带的二级倍频位于1100～1600 nm范围内，三级和四级倍频位于780～1100 nm波长范围内［14］。

表1是本实验总黄酮、花青素含量校正集和验证集的范围、平均值和标准偏差。校正集用来建立数学模型，应具有代表性，其组成要包含待测样品所包含的所有化学组分，其变化范围应大于待测样品的变化范围。由表1可知，样品验证集的含量范围都在校正集范围内，因此，本实验样品可以用于建立蓝莓总黄酮、花青素含量的近红外模型。

2.2蓝莓近红外原始光谱扫描

图1为蓝莓原始吸收光谱图。从图1中可以看出，光谱变化趋势基本保持一致，但在波长为680、975、1186、1448、1916 nm的吸收峰处有显著差异。通过WinISI4定标软件分析可知，第一个吸收峰在680 nm处，主要是由于叶绿素对光的吸收造成的［15］；而975 nm和1186 nm处的吸收峰主要是因为水分含量的差异引起的，这说明水分含量的多少对蓝莓的近红外光谱影响很大；吸收峰1448 nm附近主要是C-H、-CH2键发生变化导致的。因此，不同时间贮藏的蓝莓能提供丰富的光谱信息，通过化学计量学提取有效的光谱信息，因而应用近红外光谱技术建立蓝莓总黄酮、花青素的定量模型具有可行性。

表1　蓝莓总黄酮、花青素含量实测结果Table 1　Measured results of total flavonoids and anthocyanins in blueberries

图1　蓝莓原始光谱图Fig.1　The original spectrum of blueberries

2.3总黄酮、花青素最佳光谱预处理方法的确定

NIRS采集的原始光谱除了含有与样品本身组成相关的信息外，还可能受到测试条件、外界温度、仪器状态等因素的影响，而且样品中不同成分间的相互干扰以及成分含量的不同都有可能导致光谱重叠，因此，对采集到的原始光谱进行预处理是非常必要的，能过滤噪声，提高信噪比，消除基线飘移的干扰［16］。用不同光谱预处理方法建模结果如表2所示。

表2　不同预处理的定标结果Table 2　Calibration results of different pretreatment

图2　总黄酮一阶导数吸收光谱图Fig.2　First derivative absorbance spectrum of total flavonoids

由表2可知：D1Log（1/R）的模型优于None和D2Log（1/R）的模型，其SECV较小，Rcv2较大。对于总黄酮含量来说，光谱导数处理对相关系数Rcv2影响较大。总黄酮最佳处理条件为PLS+D1Log（1/R）+SNV and Detrend，其SECV为1.423，Rcv2为0.836；花青素最佳光谱处理条件为PLS+D1Log（1/R）+SMSC，其SECV为4.688，Rcv2为0.750。总黄酮、花青素处理后的光谱如图2、图3，从图中可以看出，一阶导数处理后的光谱图不仅消除了仪器背景的干扰和基线漂移，还去除了样品不同组分之间相互干扰造成的光谱重叠现象，使光谱中的有用信息更加清晰的显示出来，具有更清晰的光谱轮廓变化和分辨率。因此，实验研究均采用一阶导数处理。

2.4定标模型的验证

预测模型通过预测样本误差（SEP）和相关系数Rp2评价与对比所建模型的精确性。Rp2值越大，SEP越小，表明模型的预测能力越强。

图3　花青素一阶导数吸收光谱图Fig.3　First derivative absorbance spectrum of anthocyanins

为了验证模型的可靠性和稳定性，用未知的32个样品对模型进行验证。结果如图4～图5所示。预测结果表明，总黄酮的Rp2为0.7968，SEP为2.779；花青素的Rp2为0.7902，SEP为5.013。可见本实验相关性不高，其中总黄酮的模型优于花青素模型，主要是因为蓝莓果实较小，四果扫描取平均光谱，其果实间的差异可能会导致光谱偏差较大，而且蓝莓中花青素的含量高于总黄酮，测定时果实之间的差异对含量的影响很大，同时紫外分光光度计的仪器误差以及测定过程中的人为误差都会影响含量的实测值，因此，为了得到准确性更高的定标模型还需要进一步的优化与完善。

2．5总黄酮、花青素模型残差分析

使用所建的定标模型预测32个未知样品，考察模型的预测能力。图6～图7为验证样品残差分布图。

图4　蓝莓总黄酮实测值与预测值的相关性Fig.4　Correlation between predicted values of model optimized and actual values of blueberry total flavonoids

图5　蓝莓花青素实测值与预测值的相关性Fig.5　Correlation between predicted values of model optimized and actual values of blueberry anthocyanins

图6　验证集样品总黄酮实测值与预测值的残差分布图Fig.6　Distribution of residual error of measured value and predicted value of validation samples total flavonoids

图7　验证集样品花青素实测值与预测值的残差分布图Fig.7　Distribution of residual error of measured value and predicted value of validation samples anthocyanins

由图6、图7可知，从分布上看，总黄酮的残差分布较均匀，花青素的残差分布较分散；从其残差和考虑，32个样品的总黄酮、花青素的残差和分别为-0.003 mg/100g和-9.256 mg/100g，总黄酮的残差和更趋于零。综上所述，通过比较预测模型相关系数Rp2、预测标准误差（SEP）、残差分布和残差和这四项指标的分析结果，表明：蓝莓总黄酮含量的定标模型预测效果优于花青素的定标模型。

3　结论

蓝莓贮藏期间，总黄酮和花青素的含量是反映蓝莓营养价值的指标。本研究在全波长（400～2500 nm）范围内应用近红外光谱技术建立蓝莓总黄酮、花青素的无损检测模型。实验过程中采用同时测定蓝莓总黄酮和花青素含量，有效缩短传统分析方法的时间，降低蓝莓的损耗。实验结果表明，32个未知样品总黄酮、花青素的预测相关系数Rp2分别为0.7968和0.7902，预测标准误差（SEP）分别为2.779 mg/（100g）和5.013 mg/（100g），残差和分别为-0.003 mg/（100g）和-9.256 mg/（100g）。通过比较预测模型相关系数Rp2、预测标准误差（SEP）、残差分布和残差和四项指标，说明今后仍需要对近红外快速无损检测蓝莓品质进行进一步的优化和完善。

［1］钱慧碧，辛秀兰，张东升，等.溶剂提取蓝莓果渣中总黄酮的研究［J］.食品工业科技，2010，31（11）：272-274.

［2］Son J R，Lee K J，Kang S W，et al.Development of prediction model for sugar content of strawberry using NIR spectroscopy［J］. Food Engineering Progress，2009，13（4）：297-301.

［3］Louw E D，Theron K D.Robust prediction models for quality parameters in Japanese plums（Prunus salicina L.）using NIR spectroscopy［J］.Postharvest Biology and Technology，2010，58：176-184.

［4］Teerachaichayut S，Terdwongworakul A，Thanapase W，et al. Non-destructive prediction of hardening pericarp disorder in intact mangosteen by near infrared transmittance spectroscopy［J］. Journal of Food Engineering，2011，106（3）：206-211.

［5］孙炳新，匡立学，徐方旭，等.苹果有效酸度的近红外无损检测研究［J］.食品工业科技，2013，15：298-301.

［6］唐长波，方立刚.黄桃可溶性固形物的近红外漫反射光谱检测［J］.江苏农业科学，2013，41（11）：331-333.

［7］王姗姗，孙红男，陈健，等.基于近红外光谱技术检测蓝莓可溶性固形物含量［J］.食品工业科技，2012，（1）：340-369.

［8］王姗姗，李路宁，孙红男，等.基于近红外光谱技术构建蓝莓总酚含量的模型［J］.光谱实验室，2011，28（6）：3169-3174.

［9］刘燕德，陈兴苗，孙旭东.可见/近红外漫反射光谱无损检测南丰蜜桔维生素C的研究［J］.光谱学与光谱分析，2008，28（10）：2318-2320.

［10］Jia Zhi She，Tang Meng Cheng，Wu Jian Ming.The determination of flavonoid contents inmulberryandtheir scavenging effects on superoxide radicals［J］.Food Chemistry，1999，64（4）：555-559.

［11］刘海英，仇农学，姚瑞祺，等.我国86种药食两用植物的抗氧化活性及其与总酚的相关性分析［J］.西北农林科技大学学报：自然科学版，2009，37（2）：173-180.

［12］刘仁道，张猛，李新贤.草莓和蓝毒果实花青素提取及定量方法的比较［J］.园艺学报，2008，35（5）：655-660.

［13］纪淑娟，李东华，重藤和明.南果梨糖、酸度近红外光谱无损检测模型建立定标参数的确定［J］.食品科学，2008，10：512-516.

［14］宁坚刚，魏永生，耿薇，等.全谱直读电感耦合等离子体发射光谱法测定青海蕨麻中矿质元素［J］.食品科技，2012，37（10）：253-256.

［15］CAYUELA J A.Vis/NIR solids prediction in intact oranges（Citrus sinensis L）cv.Valencialate by reflectance［J］.Postharvest Biol Technol，2008，47（1）：75-80.

［16］岳绒，郭文川，刘卉.近红外漫反射光谱检测损伤猕猴桃的内部品质［J］.食品科学，2011，32（10）：141-144.

Fast non-destructive testing of total flavonoids and anthocyanins in blueberries by near-infrared spectroscope

LIU Xiao-lu1，XUE Lu1，*，LU Xiao-xiang1，ZHANG Peng2，CHEN Shao-hui2，LI Jiang-kuo2
（1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China；2.Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products，National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products，Tianjin 300384，China）

In order to establish the fast non-destructive testing of blueberry，the total flavonoids and anthocyanins in fresh blueberry were analyzed by near infrared spectroscope（NIRS）.In the spectral region between 400～2500 nm，statistical mathematical models of total flavonoids and anthocyanins in blueberry were established within broad spectrum（400～2500 nm）using the partial least squares（PLS）.The correlation coefficient were 0.836 and 0.750 respectively，and the standard errors for calibration（SECV）were 1.423 mg/（100g）and 4.688 mg/（100g）respectively.Then 32 unknown samples were predicted by the optimal models.The correlation coefficient of prediction（Rp2）were0.7968 and 0.7902 respectively，and the standard errors of prediction（SEP）were 2.779 mg/（100g）and 5.013 mg/（100g）respectively，and residual sum were-0.003 mg/（100g）and-9.256 mg/（100g）respectively.The results showed that near infrared spectroscope could be used in fast non-destructive testing of total flavonoids and anthocyanins in blueberries.

near infrared spectroscopy；blueberry；total flavonoids；anthocyanins；non-destructive testing

TS255.1

A

1002-0306（2015）16-0058-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.003

2014－12－16

刘小路（1989-），女，在读硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏，E-mail：Liuxiaolu0316@163.com。

薛璐（1976-），女，博士，副教授，研究方向：农产品加工与贮藏，E-mail：hellenxue@sina.com。

国家（十二五）科技支撑计划（2012BAD38B01）；天津市创新团队项目（TD12-5049）。