UPC2快速测定葡萄酒中抗坏血酸和异抗坏血酸含量研究

徐　莉，禤开智，纪少凡，符灵梅，蒋林蓉

（海南省出入境检验检疫局技术中心，海南海口570311）

UPC2快速测定葡萄酒中抗坏血酸和异抗坏血酸含量研究

徐莉，禤开智，纪少凡，符灵梅，蒋林蓉

（海南省出入境检验检疫局技术中心，海南海口570311）

建立了超高效合相色谱法（Ultra Performance Convergence Chromatography，UPC2）分离和测定葡萄酒中抗坏血酸和异抗坏血酸的方法。超高效合相色谱（UPC2）技术集合超临界流体色谱（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）和超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLCTM）的技术优点，流动相CO2为主体，0.1%磷酸甲醇为助溶剂。选用Waters BEH色谱柱，流速1.5 mL/min，检测波长为245 nm，方法检出限为2.0 mg/kg，定量限为6.0 mg/kg，线性范围为2.5～80.0 mg/L；加标回收率范围为93.2%～105.9%；相对标准偏差RSD为4.5%～9.8%，该方法操作便捷、检测速度快、准确性高、重复性好、节约成本，能够满足葡萄酒中抗坏血酸和异抗坏血酸的检测。

超高效合相色谱，葡萄酒，抗坏血酸，异抗坏血酸

抗坏血酸是人体必需的主要维生素之一，能够保持肌肤润滑、防止衰老、抗坏血症等。异抗坏血酸是它的同分异构体，其抗氧化能力较强，多作为食品抗氧化剂和肉类的防腐助色剂，但在耐热性和抗坏血病等活性方面弱于后者。异抗坏血酸不仅在人体代谢过程中可能会与抗坏血酸发生竞争作用，从而影响人体对抗坏血酸的吸收及生理营养作用的发挥，而且摄入过多也会导致身体的多种不适，如白细胞抗病能力下降、尿酸、结石、皮疹等［1］。

基于上述两种物质的抗氧化特性，在葡萄酒生产过程中，抗坏血酸或异抗坏血酸盐可与二氧化硫联合使用，以控制葡萄酒在贮存期间发生非酶促氧化反应［2］。异抗坏血酸作为葡萄酒的使用添加剂，其使用限量为0.15 g/kg。目前国内报道的检测方法如荧光法、比色法和滴定法，均只能测定两种物质的总量［3-4］；而液相色谱法大部分则为直接提取后采用不同的色谱柱如C18、C8、Hilic等或改变流动相检测［5-9］，但分离效果不佳且分析时间长、基质干扰大。本文拟探讨建立的超高效合相色谱（UPC2）国内尚未报道。该方法与其他方法相比不仅具有有机溶剂的使用量少，前处理操作简便，灵敏度高、重现性好、分析速度快等优点［10-13］，还能避免由于葡萄酒中天然存在的抗坏血酸干扰造成难以对食品添加剂异抗坏血酸含量的准确定量。因此，本实验通过考察超高效合相色谱分离上述两种目标物的影响因素，为口岸进出口葡萄酒质量监管提供一种准确、可靠、快速、节约型测定葡萄酒中抗坏血酸和异抗坏血酸的分离分析方法。

1　实验部分

1.1材料与仪器

甲醇、乙腈、磷酸（色谱纯） TEDIA公司；CO2（纯度99.997%） 海南嘉腾气体有限公司；抗坏血酸、异抗坏血酸均购自百灵威公司，纯度均≥99.0%。

超高效合相色谱仪配有Waters EmpowerTM3数据处理系统，美国Waters公司；MS3 digital旋涡混合器德国IKA公司；320R冷冻离心机UNIVERSAL公司；移液枪美国Thermo Electron公司。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液的配制标准贮备液：分别准确称取0.1g抗坏血酸和异抗坏血酸标准品，用含0.1%磷酸的甲醇-水（8∶2，V/V）溶液定容至10mL，摇匀，配制成1.0mg/mL混合标准储备液，0～4℃保存。

1.2.2超高效合相色谱条件色谱柱：Waters BEH 3.0 mm×100 mm 1.7 μm；柱温35℃；流动相A：CO2，B：0.1%磷酸甲醇；等度洗脱条件：CO2+0.1%磷酸甲醇（9+1）；流速1.5 mL/min；进样量2 μL；检测波长245 nm；动态背压（ABPR）1800 Psi。

1.2.3高效液相色谱条件色谱柱：Waters Hilic 2.1 mm×100 mm 1.7 μm；柱温35℃；流动相：0.1%磷酸水溶液+乙腈（1+9）；流速：0.3 mL/min；进样量5 μL；检测波长245 nm。

1.2.4样品前处理称取2.5 g葡萄酒试样（精确至0.001 g），置于50 mL具塞试管中，加入甲醇（含0.1%磷酸）-水（8∶2，V/V）溶液定容至25 mL，均质5 min，高速冷冻离心机于4℃下以12000 r/min离心10 min，取离心后液体1 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，直接进样分离分析。

2　结果与讨论

2.1液相色谱法与超高效合相色谱法的比较

基于抗坏血酸和异抗坏血酸具有弱酸性，易溶于水且不稳定的特性，测定目标物时多采取流动相比例直接提取的方式，从而避免测定物质氧化降解。为了考察超效合相色谱法在测定葡萄酒基质中的优越性，本实验将文献报道的0.1%磷酸水溶液提取高效液相色谱法测定与UPC2法进行比较发现，前者用于葡萄酒的检测不可行，两种目标物的标样分离度较佳，样品检测时却出现基质干扰、包峰、拖尾等现象，无法进行准确定量，如图1所示。这可能是由于葡萄酒基质中存在酒精所产生的溶剂效应。因此，实验利用超高效合相色谱超临界流体的特点建立提取液直接上机的方法测定葡萄酒中抗坏血酸和异抗坏血酸。考虑到UPC2系统对样品中含水量要求，本实验最终采用甲醇和水按8∶2比例直接提取上机测定葡萄酒中抗坏血酸和异抗坏血酸的含量。

2.2流速及进样量的选择

超临界CO2作为流动相兼有气体的低粘度，液体的高密度，以及介于气液体之间的扩散系数特征，分离过程可具有较高的线速度，因此流速和进样量的选择对待测物质检测的影响较大。本实验采用亚2 μm填料色谱柱，选取流速在1.2～2.0 mL/min以及进样量在1.0～5.0 μL范围内进行优化：流速过高，峰形好但长时间易造成仪器系统超压；进样量过大，峰形宽且塌陷从而影响两种目标物的分离效果。综合考虑，实验设定流速为1.5 mL/min、进样量为2.0 μL时，可保证获得较佳的分离度效果。245 nm波长下抗坏血酸和异抗坏血酸标准色谱图见图2。

图1　高效液相色谱法测定标样与加标样品色谱图比较Fig.1　The standard of chromatogram compare with spiked by HPLC

图2　D-异抗坏血酸和L-抗坏血酸标准品色谱图Fig.2　Chromatogram of standard of isoascorbic acid and ascorbic acid

2.3流动相的选择与优化

UPC2所采用的流动相是以CO2超临界流体为主体，配比不同有机溶剂作为助溶剂来调节流动相的极性及溶解性，并加入少量改性剂，从而有效改变目标物的峰形和保留时间以获得最佳的分离效果。常用助溶剂一般为甲醇、乙腈、乙酸乙酯，实验考察以上三种常用有机溶剂发现，乙腈和乙酸乙酯作为助溶剂时两种目标物均无响应，而加入磷酸改性剂的甲醇溶解能力最佳。刘倩倩等研究建立含0.05%磷酸改性剂的甲醇与CO2梯度洗脱方式测定维生素C的方法［14］，但在实验过程中发现梯度洗脱无法很好分离葡萄酒中抗坏血酸和异抗坏血酸。考虑到UPC2体系中CO2的比例最好不要低于70%，实验分别选择CO2∶甲醇（含0.1%磷酸）比例为80∶20、85∶15和90∶10进行等度洗脱，结果发现随着CO2比例增加，峰形变窄，保留时间后延，抗坏血酸和异抗坏血酸能获得较好分离度。故实验最终选择CO2∶甲醇（含0.01%磷酸）比例为90∶10等度洗脱。

2.4动态背压（ABPR）的选择

在超高效合相色谱中，动态背压是为了确保CO2在整个操作过程中处于超临界状态，当背压升高时，超临界流体密度会增大，溶剂化能力增强，由此说明它的变化也会影响物质的分离。本实验以CO2和0.01%磷酸甲醇为流动相，考察了背压在1500～2000Psi范围内对样品分离的影响。结果表明，背压降低，目标物色谱峰的保留时间减少，响应增加，柱压降低。综合考虑样品基质、保留时间及色谱柱压力三个因素，当背压为1800Psi时，抗坏血酸和异抗坏血酸能达到较好的分离。

2.5方法考察

2.5.1线性范围和灵敏度在优化实验条件下，将浓度为2.5、5.0、20.0、40.0、80.0 mg/L一系列抗坏血酸和异抗坏血酸混合标准溶液按上述色谱条件进行测定，绘制样品浓度（横坐标x，mg/L）与峰面积（纵坐标y，AU）标准曲线，进行线性回归。结果表明，该方法在2.5～80mg/L范围内有较好的线性关系，两种待测物的线性相关系数R2均大于0.998，根据S/N信噪比计算得出抗坏血酸和异抗坏血酸的检出限均为2.0mg/kg，定量限均为6.0mg/kg。

2.5.2回收率和精密度采用上述的前处理方法对阴性红葡萄酒、起泡白葡萄酒样品进行抗坏血酸和异抗坏血酸的添加回收实验，添加水平分别为10.0、50.0、150 mg/kg，按上述色谱条件进行测定。结果表明回收率在93.2%～105.9%之间，相对标准偏差（RSD）为4.5%～9.8%。结果如表1所示，方法的重现性好、精密度理想、准确性高。

表1　抗坏血酸和异抗坏血酸线性范围、相关系数及加标回收Table 1　Linear ranges，correlation coefficients（r），spiked recoveries of ascorbic acid and isoascorbic acid

2.5.3实际样品的测定利用上述实验优化条件，准确称取干红葡萄酒、干白葡萄酒和起泡白葡萄酒样各2.5 g至50 mL具塞离心管中，加入25 mL甲醇（含0.1%磷酸）-水（8+2），均质，超声提取，离心后取1 mL上清液，过滤膜，按“1.2.2色谱条件”的测定，见图3～图5，分别为抗坏血酸11.3 mg/kg，异抗坏血酸42.1 mg/kg，未检出，以上结果表明该方法可用于葡萄酒的测定，无需进行复杂的前处理，干扰小，可直接进样，直接检测。

3　结论

选用CO2和0.1%磷酸甲醇为流动相，等度洗脱，利用PDA检测方法同时测定葡萄酒中抗坏血酸和异抗坏血酸。实验结果表明：所建立的超高效合相色谱法可以快速分离上述两种待测物，前处理过程简单，分析时间短，线性相关性好，准确度高，与普通高效液相色谱法相比避免了由于基质特殊性造成分离度差难以定量的缺点，试剂使用量少，环保、运行成本低，对未来的色谱分析提供新的方向，具有较高的实用价值，可用于口岸进出口葡萄酒的监管和产品质量控制。

图3　干红葡萄酒样品色谱图Fig.3　Sample of dry red wine

图4　干白葡萄酒样品色谱图Fig.4　Sample of dry white wine

图5　起泡白葡萄酒样品色谱图Fig.5　Sample of sparking wine

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Research method of rapid determination of isoascorbic acid and ascorbic acid in wine by Ultra-performance Convergence Chromatography

XU Li，XUAN Kai-zhi，JI Shao-fan，FU Ling-mei，JIANG Lin-rong
（Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center，Haikou 570311，China）

A new method was developed for the determination of isoascorbic acid and ascorbic acid in wine by Ultra Performance Convergence Chromatography（UPC2）.The mobile phase was mixture with supercritical CO2and methanol（added 0.1%H3PO4）at a flow rate of 1.5 mL/min.Using the Waters BEH column，UV detector was set at a wavelength of 245 nm.The limit of detection was 2.0 mg/kg，the calibration linear range was 2.5～80.0 mg/L，its spiked recoveries were 93.2%～105.9%，and the relative standard deviation range from 4.5%to 9.8%.The method with high efficient，rapid，simplicity，high sensitivity and accurate results，it was applicable for determination of isoascorbic acid and ascorbic acid in wine.

Ultra Performance Convergence Chromatography（UPC2）；wine；ascorbic acid；isoascorbic acid

TS201.1

A

1002-0306（2015）16-0075-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.16.006

2014－11－14

徐莉（1981-），女，硕士研究生，工程师，研究方向：食品有害物质检测，E-mail：klppt1026@126.com。

海南省科技兴海项目（XH201407）；海南省自然科学基金项目（313105）。