发酵牦牛肉成熟过程中挥发性香气成分的变化

沙　坤，钱　聪，张泽俊，郞玉苗，李海鹏，孙宝忠（.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京009；2.中国农业大学烟台研究院食品与葡萄酒学院，山东烟台264670；.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京0008）

发酵牦牛肉成熟过程中挥发性香气成分的变化

沙坤1，2，钱聪1，张泽俊3，郞玉苗1，李海鹏1，孙宝忠1
（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；2.中国农业大学烟台研究院食品与葡萄酒学院，山东烟台264670；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

为探讨发酵牦牛肉挥发性香气成分在成熟过程中的变化规律，本文采用固相微萃取法（SPME）对各取样点样品中挥发性物质进行提取，利用气相-嗅闻-质谱联用法对其中的挥发性成分进行定性和定量分析。总计有84种挥发性成分被鉴定，其中，经嗅闻鉴定的香气活性化合物有48种，包括烃类（12）、醇类（8）、酮类（7）、醛类（3）、酸类（3）、含硫化合物（2）、酯类（4）、含氮类化合物（7）和酚类（2）。在成熟过程中，烃类和酮类含量整体呈现波动变化。醛类和酯类含量在成熟前期增加，而后又降低。酸类和吡嗪类形成于成熟过程，含量逐渐增加。烃类是成品发酵牦牛肉风味组成中含量最高的，其次是醇类、酮类及吡嗪类化合物。香辛料的添加、氨基酸的降解及微生物的代谢对发酵牦牛肉的香气形成具有重要作用。

发酵牦牛肉，气相色谱-嗅闻-质谱联用，挥发性香气成分

发酵肉是一类高档肉制品，具有色泽美观、风味独特、易消化、抗癌、耐贮存等特点，具有广阔的发展空间［1］，在世界上的很多国家和地区被广泛生产和消费。该产品的种类很多，如我国传统的干腌火腿、腊肉、腊肠等产品是借助微生物的自然发酵而成，而国外的一些国家已利用现代微生物技术定向接种有益微生物来生产西式发酵香肠和火腿。

牦牛是青藏高原地区的特有物种，牦牛肉具有低脂肪以及富含蛋白质、维E等维生素及铁等矿物质的特点［2］，加之其安全无污染的优势，备受科研工作者和消费者的关注。目前市售牦牛肉制品主要有牦牛肉干、牦牛肉脯、风干牦牛肉、酱卤牦牛肉等，产品开发档次相对较低，特色产品、精深加工产品较少。已有研究尝试以嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus，LABS）作为发酵剂来制作发酵牦牛肉，但仅对其发酵过程中的食用品质变化进行了研究［3］。通过对发酵过程中肉制品的挥发性香气分析可以了解其形成阶段和来源［4-7］，帮助调控产品的风味，而关于牦牛肉发酵成熟中的挥发性香气成分变化研究还鲜有报道。

固相微萃取（SPME）是一种比较成熟的提取挥发性风味物质的常用方法，已广泛用于食品中的风味成分的提取，具有操作简单、样品用量少、无需有机溶剂、灵敏度高、重现性好的优点［8］。而气相色谱-质谱联用（GC-MS）、气相色谱-嗅闻技术（GC-O）在对食品中风味成分的定量和定性分析中发挥了巨大作用，其中，GC-O法是以人的鼻子作为检测器，将气相色谱分离出的挥发性成分用鼻子进行嗅觉辨别，可以有效地鉴定具有活性特征的香气成分。

本研究选取甘南牦牛的半腱肌（ST）为原料肉，通过接种戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的混和发酵剂进行发酵牦牛肉的制作，应用SPME结合GC-O-MS联用法研究其发酵成熟过程中挥发性香气成分的变化，为发酵牦牛肉风味品质形成与调控提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

原料肉购买于甘肃省夏河县安多牧场，选取3头健康无病的公牦牛（4岁左右）的半腱肌，于-18℃冷冻贮藏备用；戊糖片球菌和植物乳杆菌干粉发酵剂生物试剂，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所畜产加工研究室；蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、营养琼脂生物试剂，北京奥博星生物技术有限公司；磷酸氢二纳、柠檬酸氨、乙酸钠、葡萄糖、吐温80、硫酸镁、硫酸锰分析纯，北京奥博星生物技术有限公司；食盐、蔗糖、香叶、黑胡椒粉等食品级，北京海淀区麦德龙超市；C7～C22系列烷烃色谱纯，美国Sigma公司。

7890A-7000B气-质联用仪美国安捷伦科技有限公司；Sniffer 9000嗅闻仪瑞士Brechbuhle公司；DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm）色谱柱美国J&W Scientific公司；固相微萃取装置、50/30 μm CAR/DVB/PDMS固相微萃取头美国Supelco公司；DHP-9052电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1F超净工作台苏州苏洁净化设备有限公司；HH-1超级恒温水浴锅金坛市至翔科教仪器厂；XS105电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2实验方法

1.2.1发酵牦牛肉的制作制作方法如下：

工艺要点：

原料肉解冻：将原料肉在0～4℃条件下解冻至中心温度达到4℃。

修整：将肌肉修整成形状一致的长条形，平均重量为（0.65±0.12）kg，除去表面脂肪和肌膜。

腌制：将修整后的原料肉放入腌制桶中，加入复合腌制剂，腌制剂的配比（按原料肉重计）为：1.3%食盐，0.4%葡萄糖，0.4%蔗糖，0.1%香叶，0.2%黑胡椒粉，0.1‰亚硝酸酸盐。同时，由戊糖片球菌和植物乳杆菌（1∶1）组成的复合发酵剂被接种，接种前发酵剂在MRS培养基活化并培养至108CFU/mL以上，按肉重1%添加。在腌制过程中，环境保持在2～4℃，80%～85%相对湿度的条件下，腌制时间为10 d，每隔3 d上下翻倒一次。

成熟：腌制结束后，将肉块表面的腌料冲洗干净，沥干表面水分，用人造纤维素肠衣包装，装入尼龙网袋中吊挂成熟。首先在20～22℃，60%～65%相对湿度条件下，成熟7 d，然后在（15±2）℃，70%～80%相对湿度条件下，成熟18 d。成熟结束后，每块肉样的失重率为35%左右。

1.2.2挥发性香气成分分析原料肉腌制结束后（0 d），分别取成熟第0、5、10、15、20、25 d六个时间点的肉样，用于风味成分的分析。

肉样的挥发性成分分析采用SPME结合GC-OMS联用的方法。称取6 g肉样切碎成2 mm3左右的颗粒，放入20 mL萃取瓶中，密封，50℃条件下平衡20 min。将固相萃取进样器插入萃取瓶的顶空部分，萃取40 min。然后将萃取器转移至气质联用仪，在250℃解吸7 min，同时启动仪器采集数据。

气谱条件：毛细管柱为DB-WAX柱，程序升温：起始温度40℃，保持3 min，然后以5℃/min的速度升温到200℃，再以10℃·min-1的速度升温到230℃，保持3 min，气化室温度250℃；载气为He，流速0.8 mL·min-1，分流比10∶1。

质谱条件：电离方式为EI，电子能量70 eV，接口温度250℃，传输线温度280℃，离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，扫描范围55～500 m/z。

化合物的定性使用三种方法，一种是通过保留时间与NIST 2.0质谱数据库比对进行鉴定，相似指数和反相似指数均大于800的为鉴定化合物，另一种是使用标准系列烷烃（C7～C22）在相同气质测定条件下进行分析，测定化合物的保留时间并计算保留指数（Retention Indices，RI）［9］，并与网站www.odour.org.uk上已发表文献中的RI值进行比较来鉴定化合物。同时，以3位有经过训练的感官分析人员嗅闻鉴定香气成分。根据化合物的峰面积，通过面积归一化法定量分析挥发性成分的相对含量，每个样品平行测定3次。

1.3统计分析

采用SPSS 19.0统计分析软件对数据进行方差分析（Duncan法）。

2　结果与分析

发酵牦牛肉成熟过程中挥发性香气成分变化如表1所示，在各取样点共检测出84种挥发性化合物，包括烃类20种、醇类17种、酮类11种、醛类8种、酸类5种、含硫化合物2种、酯类7种、吡嗪类5种、其他成分9种。其中，经嗅闻鉴定的活性香气成分有48种，包括12种烃类、8种醇类、7种酮类、3种醛类、3种酸类、2种含硫化合物、4种酯类、7种含氮类化合物和2种酚类。在腌制结束后（成熟0 d），共检测到44种化合物，而在成熟结束后（成熟25 d），共检测到63种化合物，挥发性成分的种类大量增加。

表1　发酵牦牛肉成熟过程中挥发性香气成分的变化（%）Table 1　Changes of volatile aroma compounds during ripening of fermented yak meat（%）

续表

续表

2.1发酵牦牛肉成熟过程中挥发性香气成分的变化及来源

2.1.1烃类烃类总含量在成熟中未呈现明显的规律变化（p＜0.05），在成熟15 d时含量最高（49.07%）。甲苯、乙苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯等芳香烃类可能来自动物的饲料，其沉积在动物的脂肪中［10］，它们赋予了产品芳香味和甜味。因其香气阈值较低，芳香烃类是干腌牛肉中重要的风味物质［6］。3-蒈烯、β-蒎烯、水芹烯、右旋柠檬烯、松油烯、苯乙烯等萜烯类物质与香辛料（特别是胡椒）的添加有很大关系［6］。它们分别赋予发酵牦牛肉松木香、玫瑰香、薄荷味、柠檬香、果香、甜味，而萘和2-甲基萘则有可能是由环境污染物带来［11］。

2.1.2醇类成熟0 d时，醇类总含量最高（32.60%），在成熟过程中呈下降的趋势，但在统计学上不显著（p＞0.05）。桉叶油醇、芳樟醇、α-松油醇、对甲基苯异丙醇、苯甲醇从成熟0 d就被检测到，它们可能来源于腌制时添加的香料，而3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇和苯乙醇成熟0 d并未检测到，它们形成于成熟过程中。3-甲基-1-丁醇是亮氨酸通过Strecker降解而形成［12］，具有清香味。1-辛烯-3-醇是不饱和脂肪酸的氧化产物［13］，具有蘑菇香气。

2.1.3酮类酮类总含量从成熟0～10 d过程中，由2.59%显著增加到17.42%（p＜0.05），之后又出现了波动的变化，成熟25 d时含量为12.56%。其中，2-庚酮、2-羟基-3-戊酮、4-羟基-4-甲基-2-戊酮、2-壬酮、苯乙酮在成熟0 d时并未检测到，它们形成于成熟的过程中。一些甲基酮类（如丙酮、丁酮、2-戊酮、2-庚酮、2-壬酮、苯乙酮等）的生成与微生物引起的脂肪酸的β氧化相关，而3-羟基-2-丁酮则来源于糖类的微生物代谢［12］。在本研究中，除丙酮被鉴定有酸臭味以外，多数酮类具有奶香和甜香。

2.1.4醛类醛类总含量在成熟过程中总体上看呈现先增加又降低的趋势，最高含量出现在成熟5 d（2.46%）。在成品发酵牦牛肉中仅检测到两种醛类，壬醛是不饱和脂肪酸氧化的产物［13］，具有青草香气，而苯甲醛可能由氨基酸代谢产生［10］，具有苦杏仁味。

2.1.5酸类酸类总含量在成熟过程中总体上看呈现增加的趋势，成熟20 d时含量最高为4.32%，与成熟25 d的含量没有显著差异（p＞0.05）。三种酸类如乙酸、2-甲基丙酸和3-甲基丁酸经嗅闻被鉴定，带有酸味、腐臭的味道，在金华火腿中同样检测到了它们的存在［14］，主要来源于微生物的代谢反应，说明微生物在发酵牦牛肉的成熟过程中起到了较大的作用。

2.1.6含硫化合物本研究中仅检测到了两种含硫化合物如二甲基二硫醚和3-甲硫基丙醇，它们可能来源于含硫氨基酸如半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸的Strecker降解，这些氨基酸降解后生成硫醇，硫醇可以进一步氧化形成二甲基二硫化合物［14］，赋予产品葱香，肉香味。含硫化合物具有低阈值的特点，对发酵牦牛肉的风味形成将有重要作用。

2.1.7酯类酯类总含量在成熟过程中呈现先增加又降低的趋势，最高含量为成熟15 d时的3.16%。酯类是由羧酸和醇类通过微生物的酯化作用而生成。本研究中检测到四种有香气的酯类，包括甲酸乙酯、乙酸芳樟酯、γ-癸内酯和γ-十二内酯，它们具有花香和果香，且香气阈值较低，对发酵牦牛肉的风味将有重要贡献。

2.1.8吡嗪类吡嗪类在成熟5 d时（含量为1.93%）才开始被检测到，其后含量逐渐增加（p＜0.05），成熟25 d时达到5.60%。5种吡嗪类物质赋予发酵牦牛肉熟制的味道如炒花生、坚果香、杏仁味、烤香等气味。在金华火腿［14］中，同样检测到了吡嗪类物质的存在，它们可能源于氨基酸Strecker降解反应，氨基酸在发生Strecker反应后的主要产物氨基酮异构为烯醇胺，而后环化生成吡嗪类物质［15］。这些在成熟过程中代谢产生的吡嗪类物质对发酵肉制品的特征风味形成具有重要作用。

2.2成品发酵牦牛肉挥发性风味组成分析

在成品发酵牦牛肉挥发性成分的组成中，烃类含量最高（31.29%），其次是醇类（21.40%）、酮类（12.56%）和吡嗪类（5.60%）。这一结果与Kaban［6］的报道相似，烃类也是土耳其干腌牛肉“pastirma”的风味组成中最丰富的成分。但是发酵牦牛肉的风味组成却不同于另外的几类干腌或发酵肉制品。例如，在克罗地亚和西班牙的干腌猪火腿中［13，16］，脂肪氧化产物醛类是最丰富的；在西班牙的干腌马肉“Cecina”［7］产品中，酯类物质是含量最高的；而在意大利的“San Daniele”火腿［17］中醇类是含量最高的组成成分。原料肉的性质差异、加工工艺的不同及香辛料等配料使用的不同可能是导致各类产品风味组成差异的原因，也正因此形成了各自产品的独特风味品质。

3　结论

在发酵牦牛肉的挥发性成分检测中，通过气相色谱-质谱方法共检测到84种化合物，其中经GC-O方法鉴定的活性香气成分有48种，包括12种烃类、8种醇类、7种酮类、3种醛类、3种酸类、2种含硫化合物、4种酯类、7种含氮类化合物和2种酚类。在成熟过程中，烃类和酮类含量整体呈现波动变化。醛类和酯类含量在成熟前期增加，而后又降低。酸类和吡嗪类形成于成熟过程，含量逐渐增加。成品发酵牦牛肉挥发性成分中，烃类是含量最高的，其次是醇类、酮类及吡嗪类化合物，这些成分主要来自腌制阶段添加的香辛料、氨基酸的降解及微生物的代谢。

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Changes in volatile aroma compounds during ripening of fermented yak meat

SHA Kun1，2，QIAN Cong1，ZHANG Ze-jun3，LANG Yu-miao1，LI Hai-peng1，SUN Bao-zhong1
（1.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.College of Food and Wine，Yantai Research Institute of China Agricultural University，Yantai 264670，China；3.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

The objectives of this study were to discuss the changes in volatile aroma compounds of fermented yak meat during ripening.Volatile compounds in fermented yak meat were extracted by solid-phase micro extraction（SPME）.Gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry（GC-O-MS）was used to identify and quantify these compounds.A total of 84 volatile compounds were identified.Among these compounds，48 aroma-active compounds were identified by GC-O，including hydrocarbons（11），alcohols（8），ketones（7），aldehydes（3），carboxylic acids（3），sulfocompound（2），esters（4），nitrogenous compounds（7），and phenols（2）. During ripening，the content of hydrocarbons and ketones showed fluctuation changes.The content of aldehydes and esters increased during the first ripening stage，and then decreased.Carboxylic acids and pyrazines were formed and increased during ripening.Hydrocarbons were the most abundant volatile compounds in the final product，followed by alcohols，ketones，and nitrogen compounds.Spices，amino acids degradation，and microbial metabolism played a key role in the flavour formation of fermented yak meat.

fermented yak meat；GC-O-MS；volatile aroma compounds

TS251.5

A

1002-0306（2015）24-0076-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.24.007

2015－05-06

沙坤（1978-），女，博士，副教授，主要从事畜产品加工与质量安全方面的研究，E-mail：405562127@qq.com。

孙宝忠（1964-），男，博士，研究员，主要从事畜产品加工与质量安全方面的研究，E-mail：baozhongsun@163.com。

公益性行业（农业）科研专项（201203009）；国家牦牛肉牛产业技术体系资助项目（CARS-38）；国家自然科学基金资助项目（31460403）。