应用链霉素药敏片进行秀珍菇组织分离的研究

刘盛荣 张维瑞 朱颖萱 匡云波

（宁德师范学院生物系，福建 宁德 352100）

应用链霉素药敏片进行秀珍菇组织分离的研究

刘盛荣 张维瑞 朱颖萱 匡云波

（宁德师范学院生物系，福建 宁德 352100）

利用不同载药量链霉素药敏片进行秀珍菇组织分离试验。结果显示：秀珍菇组织分离的细菌污染率，高达82.14%，而以放置载药量为10 μg/片和300 μg/片链霉素药敏片作为抑制细菌污染的方法，则污染率分别降至46.43%和7.14%。结论是利用链霉素药敏片抑制细菌污染可有效提高秀珍菇组织分离成功率。

秀珍菇；组织分离；链霉素药敏片；抑制细菌污染

秀珍菇（Pleurotus pulmonarius），是近年来发展较快的一种珍稀食用菌新品种。秀珍菇子实体单生或丛生，菌肉肥嫩，味鲜爽口，有鲜甜海鲜味，营养丰富，蛋白质含量比一般蔬菜高3～6倍，富含人体必需的8种氨基酸和多种维生素，特别是硒含量高，因此越来越受到人们的重视[1]。

朱坚等[2]采用ITS-RFLP评估由台湾引进的秀珍菇种质资源，发现36株命名为秀珍菇的菌株均为糙皮侧耳和凤尾菇。由于秀珍菇遗传背景单一，其长远发展存在潜在隐患，因此秀珍菇菌种选育成为一重要研究课题。组织分离法是通过食用菌子实体的部分组织获取纯菌种的技术，所获得的纯菌种遗传性状稳定，是选育优良菌种的简便有效方法[3]。

食用菌组织分离中常用75%乙醇、0.1%升汞或气雾消毒剂对子实体或组织块进行消毒[4～6]，以减少污染，提高分离成功率。通过向培养基添加抗生素抑制细菌或真菌污染的方法也是食用菌组织分离的常用方法[7]。秀珍菇子实体小、菌柄细、菌肉薄，组织分离易受细菌污染。本研究以商业链霉素药敏片作为抑制细菌污染的方法研究秀珍菇组织分离。

1 材料与方法

1.1 供试材料

于2015年6月底至8月初，从本地市场挑选新鲜、菌盖边缘内卷、菌柄稍细的秀珍菇子实体作为供试的组织分离材料。

1.2 仪器及试剂

超净工作台、镊子、刀片、酒精灯和培养皿等；载药量为10 μg/片和300 μg/片的链霉素药敏片（直径0.5 cm）购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，自来水1 000 mL。121 ℃灭菌20 min。

1.4 试验方法

（1）平板制作及药敏片放置。装于三角瓶的PDA培养基经微波炉熔化后放置于超净工作台上，温度不烫手时倒入平板，每皿约15～20 mL。凝固后用镊子夹取药敏片放置在培养皿培养基的表面中心位置。

（2）组织分离。以75%乙醇将新鲜菇体擦拭消毒；沿菌柄对半掰至菌盖分成两半，露出内部组织的一面朝上放置；用灭菌的锋利刀片切取菌柄和菌盖组织，使每一组织块约为黄豆粒大小。

挑取组织块，在离药敏片边缘0.5 cm处的周围对称放置4个，Parafilm封口膜封口，25 ℃恒温培养。以不放置药敏片的组织块为对照。每一处理做7个平板，即28个重复。

（3）分离纯化。培养3～7天后观察细菌污染及菌丝萌发情况；挑取萌发组织块尖端菌丝（含培养基）至斜面作为组织分离株继续培养，进一步观察有无细菌污染。

2 结果与分析

2.1 应用链霉素药敏片的秀珍菇组织分离效果

图1 A为放置链霉素药敏片（载药量为300 μg/片）的组织分离培养菌落，B为未放置药敏片的对照。从图中可以看出，放置药敏片的秀珍菇组织块无细菌污杂，经尖端菌丝分离，菌丝萌发生长，极少发生细菌污染，成功分离到纯化菌种；未放置药敏片的组织块出现明显细菌污染，而未观察到菌丝萌发。由此可知，在本实验条件下链霉素药敏片的扩散药物可有效抑制秀珍菇的细菌污染，提高了组织分离的成功率。

图1 链霉素药敏片组织分离菌丝生长

表1 不同载药量链霉素药敏片秀珍菇的组织分离结果

2.2 不同载药量链霉素药敏片的组织分离结果

表1显示载药量为10 μg/片和300 μg/片的链霉素药敏片的组织分离结果。未放置药敏片的对照细菌污染率为82.14%；利用载药量为10 μg/片和300 μg/片链霉素药敏片的组织分离细菌污染率分别下降至46.43%和7.14%。可见链霉素药敏片应用于秀珍菇食用菌组织分离可显著提高其成功率。

3 讨 论

食用菌组织分离属无性繁殖方式，是最常用的菌种分离技术，主要用于野生菌种分离、菌种复壮以及菌种选育等。朱福锦等[8]采用组织分离法成功分离野生粗柄羊肚菌；刘晓龙等[9]利用组织分离法成功分离野生胶陀螺菌；此外，组织分离在北虫草、野生猪芩等菌种分离上也得到应用[10，11]。柯丽娜[12]基于组织分离法复壮商业栽培白背毛木耳菌种，分离株菌丝生长速度提高10.3%～13.5%，产量提高2.7%～6.2%，污染率降低11.48%～38.55%。王波等[13]通过组织分离选育黄背木耳，产量提高16.48%～90.85%。

由于食药用菌的多样性，组织分离技术的改进一直受到研究人员重视[6,14,15]。本研究利用放置链霉素药敏片的方法抑制细菌污染，与传统的直接将抗生素添加至培养基的方法相比，药敏片中的药物是通过扩散作用释放至培养基，在其周围形成浓度梯度，离药敏片越近，药物浓度越高；反之，越低。该分布特点对呈辐射状生长的菌丝毒性作用不断减轻，是用于食药用菌组织分离的一种较理想的方法。

[1] 黄毅. 食用菌栽培[M]. 北京: 高等教育出版社, 2008: 166.

[2] 朱坚, 刘新锐, 谢宝贵, 等. 秀珍菇种质资源的ITS-RFLP分析[J]. 福建农林大学学报(自然科学版), 2009, 38(2): 186-191.

[3] 王波, 彭卫红, 甘炳成. 金针菇33个菌株遗传多样性及组织分离菌株鉴定的酯酶同工酶分析[J]. 西南农业学报, 2008, 21(2): 448-450.

[4] 尹晓宇, 张兴梅. 黑木耳组织分离改进方法研究[J]. 黑龙江农业科学, 2015(3): 132-134.

[5] 李云龙, 刘柱. 黑木耳的组织分离技术[J]. 食药用菌, 2008, 16(3): 27.

[6] 刘光彥. 一种快速简便的黑木耳组织分离新法[J]. 贵州农业科学, 2005, 33(1): 73.

[7] 柳叶飞, 张林, 赵同心, 等. 野生食用菌户外组分专用培养基的研制[J]. 现代园艺, 2014(10): 5-8.

[8] 朱锦福, 雷艳, 李鹏业. 粗柄羊肚菌生境及组织分离优化条件的研究[J]. 安徽农业科学, 2012, 40(24): 11966-11967.

[9] 刘晓龙, 刘振钦, 李晓, 等. 胶陀螺菌种分离及驯化栽培研究[J]. 吉林农业大学学报, 2002(2): 75-77.

[10] 李青苗, 郭俊霞, 王晓宇, 等. 北虫草组织分离子实体生长情况的研究[J]. 安徽农业科学, 2015, 43(15): 3-4.

[11] 李雯瑞, 陈德育, 梁宗锁, 等. 野生高产猪芩菌株分离培养条件研究[J]. 西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2014, 42(2): 179-186.

[12] 柯丽娜. 白背毛木耳组织分离菌株栽培对比试验[J].福建农业学报, 2014, 29(5): 465-468.

[13] 王波, 李婧, 鲜灵, 等. 毛木耳黄背木耳菌株组纪分离物遗传差异与农艺性状分析[J]. 西南农业学报, 2012, 25(2): 6012-604.

[14] 李晓, 孟秀秀, 代月婷, 等. 黑木耳简单快速组织分离新法[J]. 中国食用菌, 2014, 33(6): 11-12.

[15] 许祖国, 郑秋芬. 金针菇母种组织分离法的改进[J]. 中国食用菌, 1997, 16(2): 20.

Using streptomycin-containing paper disc as a means of preventing bacteria contamination from tissue isolation of Pleurotus pulmonarius

Liu Shengrong, Zhang Weirui, Zhu Yingxuan, Kuang Yunbo
(Department of Biology, Ningde Normal University, Ningde Fujian 352100)

To simplify tissue isolation of Pleurotus pulmonarius and improve efficiency, commercial streptomycincontaining drug sensitivity paper disc (0.5 cm in diameter) was utilized for inhibiting bacteria present in the tissue isolated. Prior to isolation, one streptomycin-containing drug sensitivity paper disc was placed on the center surface of medium in a Petri dish and then tissue plugs were potted around it 0.5 cm apart. The results indicated that, out of 28 tissue plugs, 82.14% exhibited seriously bacteria contamination, while considerably decreased contamination rates as 46.43% and 7.14% were observed， respectively， when streptomycin contents of 10 μg and 300 μg of drug sensitivity paper discs were employed. From these findings, the use of drug sensitivity paper disc of streptomycin is an effective method to improve tissue isolation efficiency.

Pleurotus pulmonarius; tissue isolation; streptomycin-containing paper disc; bacteria contamination preventing

S646

A

2095-0934（2015）05-307-03

福建省科技厅引导性项目（2015N0032）；校博士启动项目（2013Y008）

刘盛荣，男，从事食用菌育种及液体深层发酵研究。E-mail：fjhost@163.com